扩增T细胞群的方法与流程

背景技术：

1、通过基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)的肿瘤特异性t淋巴细胞的产生正作为引发强大抗肿瘤作用的合成生物学形式获得关注(jena等人，2010,blood.116:1035-1044；bonini等人，2011,biol blood marrow transplant17(1增刊):s15-20；restifo等人，2012,nat rev immunol 12:269-281；kohn等人，2011,mol ther 19:432-438；savoldo等人，2011,j clin invest121:1822-1825；ertl等人，2011,cancer res 71:3175-3181)。因为特异性是由抗体片段赋予的，所以car-t细胞不是mhc限制性的，因此比需要mhc匹配的基于t细胞受体的方法更实用。

2、因此，car-t细胞疗法代表个性化癌症治疗的主要进步。在该策略中，患者自身的t细胞经基因工程化以表达结合肿瘤抗原的合成受体。然后将car-t细胞扩增用于临床用途，并输注回患者体内以攻击和破坏化学疗法抗性癌症。在b细胞恶性肿瘤的car-t细胞疗法的背景中已经观察到明显的临床反应和高完全缓解率。这导致fda最近批准两种针对cd19蛋白的car-t细胞用于治疗急性淋巴细胞白血病和弥漫性大b细胞淋巴瘤。因此，car-t细胞可论证地是合成生物学和个性化细胞癌症疗法变成可商购获得的首批成功的例子之一。

3、尽管car-t细胞疗法最近取得成功，但本领域仍需要更好地改进t细胞扩增方法。

技术实现思路

1、本公开涉及一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd3+t细胞；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养cd3+t细胞；(c)活化cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导cd3+t细胞，以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养car-t细胞；以及(f)收获car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。本公开还涉及一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)获得包含cd3+t细胞群的样品；(b)在包含人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养cd3+t细胞；(c)活化cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导cd3+t细胞，以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。本公开还涉及一种扩增t细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在含有人白细胞介素21(il-21)的培养基中培养cd3+t细胞；(c)活化cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核酸的载体转导cd3+t细胞，以产生car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；(e)在培养基中培养car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞；以及(f)收获car-t细胞或t细胞受体(tcr)细胞。在一些方面，该培养基还包含人白细胞介素2(il-2)。

2、在一些方面，部分(d)包括用包含编码car的核酸的载体转导cd3+t细胞以产生car-t细胞。在一些方面，部分(d)包括用包含编码tcr的核酸的载体转导cd3+t细胞以产生tcr细胞。在一些方面，在步骤(b)中在该培养基中培养约1×106个至约1×109个cd3+t细胞。在一些方面，样品是经由白细胞单采术收集的富集单采产物。在一些方面，将步骤(c)中的cd3+t细胞培养约一天或约两天。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用cd2、cd3、cd28或它们的任何组合的激动剂活化。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用磁性微珠活化。在一些方面，步骤(c)中的cd3+t细胞用抗cd3抗体或其cd3结合片段以及抗cd28抗体或其cd28结合片段活化。在一些方面中，该抗cd3抗体或其cd3结合片段以及该抗cd28抗体或其cd28结合片段与磁性微珠偶联。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约两天至约十天。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约四天至约六天。在一些方面，car-tt细胞在步骤(e)中培养约四天。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)中培养约六天。在一些方面，人il-21的浓度为约0.01u/ml至约0.3u/ml，并且人il-2的浓度为约5iu/ml至约100iu/ml。在一些方面，人il-21的浓度为约0.19u/ml。在一些方面，人il-2的浓度为约40iu/ml。在一些方面，在步骤(b)期间搅拌cd3+t细胞。本公开的方法涉及一种制造t细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)从样品中分离cd4+和cd8+t细胞以形成cd3+t细胞群；(b)在包含浓度为40iu/ml的人白细胞介素2和浓度为0.19u/ml的人白细胞介素21的培养基中培养cd3+t细胞；(c)用包含抗cd3抗体或其cd3结合片段以及抗cd28抗体或其cd28结合片段的磁珠活化cd3+t细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的慢病毒载体病毒转导cd3+t细胞以产生car-t细胞；(e)在培养基中培养car-t细胞约四天；以及(f)收获car-t细胞。

3、在一些方面，通过正向选择分离cd4+和cd8+t细胞。在一些方面，该载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、转座子、dna载体、mrna、脂质纳米颗粒(lnp)或crispr-cas系统。在一些方面，该载体是慢病毒。在一些方面，以约0.25至约20的感染复数(moi)添加慢病毒。在一些方面，以约1至约4的moi添加慢病毒。在一些方面，以约2或约4的moi添加慢病毒。在一些方面，细胞培养基的体积在步骤(d)之后增加。在一些方面，细胞培养基的体积增加至少6倍。

4、在一些方面，步骤(e)中的培养基每天更换至少一次。在一些方面，步骤(e)中的培养基每12小时更换。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。在一些方面，car与steap2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)结合。在一些方面，car编码与steap2结合的抗原结合结构域，并且其中该抗原结合结构域包含：

5、(a)包含seq id no:1中所示的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq id no:2中所示的氨基酸序列的vl-cdr2、包含seq id no:3中所示的氨基酸序列的vl-cdr3、包含seq id no:4中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq id no:5中所示的氨基酸序列的vh-

6、cdr2、包含seq id no:6中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

7、(b)包含seq id no:11中所示的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seqid no:12中所示的氨基酸序列的vl-cdr2、包含seq id no:13

8、中所示的氨基酸序列的vl-cdr3、包含seq id no:14中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq id no:15中所示的氨基酸序列的vh-cdr2、包含seq id no:16中所示的氨基酸序列的vh-

9、cdr3；

10、(c)包含seq id no:21中所示的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seqid no:22中所示的氨基酸序列的vl-cdr2、包含seq id no:23

11、中所示的氨基酸序列的vl-cdr3、包含seq id no:24中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq id no:25中所示的氨基酸序列的vh-cdr2、包含seq id no:26中所示的氨基酸序列的vh-

12、cdr3；

13、(d)包含seq id no:31中所示的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seqid no:32中所示的氨基酸序列的vl-cdr2、包含seq id no:33

14、中所示的氨基酸序列的vl-cdr3、包含seq id no:34中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq id no:35中所示的氨基酸序列的vh-cdr2、包含seq id no:36中所示的氨基酸序列的vh-

15、cdr3；或

16、(e)包含seq id no:41中所示的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seqid no:42中所示的氨基酸序列的vl-cdr2、包含seq id no:43

17、中所示的氨基酸序列的vl-cdr3、包含seq id no:44中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq id no:45中所示的氨基酸序列的vh-cdr2、包含seq id no:46中所示的氨基酸序列的vh-

18、cdr3。在一些方面，该car包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，该car编码与gpc3结合的抗原结合结构域，并且其中该抗原结合结构域包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中该vh包含：包含seq id no:112的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no:113的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no:114的氨基酸序列的cdr3，并且其中该vl包含：包含seq id no:115或seqid no:118的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no:116或seqid no:119的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no:117或seqid no:120的氨基酸序列的cdr3。在一些方面，该vh包含seqid no:108或seq id no:110的氨基酸序列，并且该vl包含seqid no:109或seq id no:111的氨基酸序列。在一些方面，该核酸还编码装甲分子(armoringmolecule)。

19、在一些方面，该装甲分子包含显性阴性tgfβ受体2型(tgfβriidn)。在一些方面，该装甲分子包含与seq id no:105中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，该装甲分子包含seq id no:105中所示的氨基酸序列。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞配制在等渗溶液中。在一些方面，该等渗溶液包含含有人血清白蛋白的plasmalyte。在一些方面，该等渗溶液含有约1×106个至约1×109个car-t细胞或tcr细胞。在一些方面，该等渗溶液含有约3.4×106个car-t细胞或tcr细胞。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞是tcm细胞和tscm细胞的混合物。在一些方面，约20％至约50％的car-t细胞或tcr细胞表达cd45ra、ccr7和cd27但不表达cd45ro。在一些方面，约20％至约30％的car-t细胞或tcr细胞是tscm细胞，并且表达cd45ra、ccr7和cd27但不表达cd45ro。在一些方面，超过50％的car-t细胞或tcr细胞表达嵌合抗原受体或t细胞受体。在一些方面，约40％至约60％的car-t细胞或tcr细胞表达嵌合抗原受体或t细胞受体。在一些方面，超过50％的car-t细胞或tcr细胞表达cd8。在一些方面，约40％至约60％的car-t细胞或tcr细胞表达cd8。

20、在一些方面，car-t细胞或tcr细胞具有高于100pmol/min的耗氧速率(ocr)。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞具有约50pmol/min至约200pmol/min的ocr。在一些方面，car-t细胞或tcr细胞具有高于30mph/min的细胞外酸化速率(ecar)。在一些方面中，car-t细胞或tcr细胞具有约30mph/min至约60mph/min的ecar。