一种天然无载体小分子水凝胶及其作为抗菌、免疫调节、抗炎和抗氧化药物的应用

本发明为β-d-五没食子酰葡萄糖无载体水凝胶的制备方法及其作为抗菌、免疫调节、抗炎和抗氧化药物的应用，尤其是对临床上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑制作用，显示出广谱抗菌活性，并且还显现出良好的免疫调节以及抗氧化活性；此外，还具有良好的生物安全性，进一步保证临床用药安全。其具备自组装性能，可以制备成无载体水凝胶药物，属于药物化学领域。

背景技术：

1、皮肤创伤愈合的过程可以分为炎症、增殖和组织重塑三个互相重叠但又不相同的阶段。过度的炎症会延迟伤口从炎症到下一个增殖阶段的愈合过程，而巨噬细胞由于其多功能而成为这一过程的关键调节因子。巨噬细胞向m2型极化的免疫调节促进了炎症期向增殖期的过渡，已被证明是促进皮肤创面愈合的有效途径。因为，m2表型巨噬细胞可通过分泌抗炎细胞因子和生长因子调节炎症、促血管生成和诱导组织再生。此外，在皮肤创伤的治疗过程中很容易面临细菌感染。一旦细菌在伤口聚集，则会促使巨噬细胞倾向于极化为m1表型，并降低巨噬细胞从m1到m2的表型转换。m1表型巨噬细胞在伤口部位大量积累，则会分泌大量促炎细胞因子，加重炎症反应，并产生氧化应激，最终导致伤口愈合延迟。因此，开发具有抗菌并能调节巨噬细胞表型和抗氧化的多功能生物材料敷料在加速伤口愈合方面具有广泛的应用潜力。

2、水凝胶由于其独特的三维多孔网络和亲水性结构，有利于氧气交换，吸收伤口渗出物，维持有利的潮湿环境，并为装载细胞和其他促进伤口愈合的生物分子提供合适的递送系统，被作为有前途的伤口敷料受到广泛关注。然而既往报道的水凝胶多是以高分子聚合物为主，天然活性小分子自组装形成水凝胶的报道较少且结构母核较为单一。生物活性天然小分子化合物定向自组装成水凝胶具有自我修复、刺激响应性能、生物相容性和生物降解性等优异性能，在药物递送、伤口愈合、组织工程等生物医学应用中具有巨大潜力。预计这些水凝胶具有高治疗效果、温和释放和无细胞毒性的特点。尽管进行了大量的努力，但使用天然活性小分子化合物设计自组装水凝胶仍然是一个艰巨的挑战。天然小分子的自组装主要依赖于分子结构内亲水性和疏水性基团的良好比例以及在水中的完美平衡，包括分子间相互作用、手性和空间分子排列。由于大多数天然小分子缺乏这些精细的结构，通常需要复杂且多种有机溶剂和催化剂参与的合成路线，通过化学修饰制备分子前体，以形成所需的水凝胶。

3、本发明以中药植物小分子成分β-d-五没食子酰葡萄糖为原料，利用超分子化学技术，在不添加任何辅料，以及不经过任何结构修饰和前处理的条件下，通过β-d-五没食子酰葡萄糖特异性自组装能力，成功的开发出了一种新型的天然无载体小分子水凝胶。然而，其差向异构体α-d-五没食子酰葡萄糖在相同条件下则不能自组装形成水凝胶。并且，这也是首次从鞣制类分子成分中发现在不经任何结构修饰和前处理的条件下能够自组装形成水凝胶的小分子化合物，并为未来新型天然水凝胶的开发提供了指导，从而丰富了现有的小分子水凝胶的结构类型库。

技术实现思路

1、在超分子化学理论基础上，发明人创新性发现，β-d-五没食子酰葡萄糖在不添加任何辅料，以及不经过任何结构修饰和前处理的条件下便能自组装成水凝胶。然而，其差向异构体α-d-五没食子酰葡萄糖在相同条件下则不能自组装形成水凝胶。β-d-五没食子酰葡萄糖所形成的超分子水凝胶具有可注射性、热敏性、自愈合性以及稳定性，可作为理想的创面敷料应用于临床。此发明对于从天然中药中发现和开发结构明确的天然水凝胶药物具有重大的研究意义，打破了既往小分子水凝胶结构类型单一，且往往需要借助高分子材料成胶的瓶颈；创新性提出“传统药物分子+生物医药材料功能”的设计理念，指导具有超分子特征的组分新药研发！

2、本发明的目的之一是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶。

3、本发明的目的之二是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶的制备方法。

4、本发明的目的之三是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶的优良凝胶材料学性质。

5、本发明的目的之四是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶在抗菌领域的应用。

6、本发明的目的之五是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶在抑制细菌生物膜形成领域的应用。

7、本发明的目的之六是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶在抗氧化领域的应用。

8、本发明的目的之七是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶在抗炎和免疫调节领域的应用。

9、本发明的目的之八是提供β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶在促进细菌感染的伤口愈合领域的应用。

10、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

11、1.通过探索不同条件确定制备β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶的制备工艺。

12、(1)称取不同质量的β-d-五没食子酰葡萄糖混悬于水中，加热搅拌均匀。

13、(2)将步骤(1)中所制备的β-d-五没食子酰葡萄糖水溶液静置放冷。

14、优选地，步骤(1)中所述β-d-五没食子酰葡萄糖质量浓度为6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml。

15、优选地，步骤(1)中所述用水为去离子水或超纯水。

16、优选地，步骤(1)中所述加热温度为25-100℃，例如25℃，30℃，50℃，80℃，100℃。

17、优选地，步骤(1)中所述搅拌速度为0-1500rpm，例如100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm或1500rpm。

18、优选地，步骤(2)中所述静置放冷条件为室温或者4℃。

19、2.对β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶进行流变学研究。

20、主要研究步骤如下：

21、通过频率扫描与振幅扫描对β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶进行材料学表征。

22、3.通过对不同菌种的mic值测定，评估其抑菌效果；通过扫描电镜观察其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌微观形貌的影响。

23、β-d-五没食子酰葡萄糖水凝胶其抗菌评价包括以下步骤：

24、(1)通过肉汤稀释法检测β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶对金黄色葡萄菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mic值。

25、(2)扫描电镜观察1/3mic给药浓度对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态学影响。

26、4.通过xtt定量试验，评估其抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜生成效果；通过扫描电镜和激光共聚焦表征进一步验证其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜生成的抑制效果。

27、主要研究步骤如下：

28、使用高糖培养基将不同浓度的β-d-五没食子酰葡萄糖水凝胶与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌共同培养24小时后，用注射器轻轻吸走培养基并用pbs清洗游离的细菌。加入xtt染料并避光孵育2小时后在450nm下测定其吸光度。

29、5.通过对不同自由基的清除率测定，评估其抗氧化效果。

30、β-d-五没食子酰葡萄糖水凝胶其抗氧化效果评价包括以下步骤：

31、(1)配置200μm的dpph母液，然后加入不同浓度的β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶，避光孵育30分钟后，于517nm处测定吸光度。

32、(2)将feso4、水杨酸和不同浓度的β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶样品溶液依次加入离心管中，最后加入h2o2开始反应。37℃孵育30分钟后，在510nm处测定吸光度。

33、6.通过对不同促炎因子抑制率的测定，评估其抗炎效果。

34、主要研究步骤如下：

35、用脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞raw 264.7形成炎症模型，然后加入不同浓度的β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶继续孵育24小时后，测定β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶对lps诱导巨噬细胞所产生的炎症因子(tnf-α、il-lβ、il-6和no)的影响以评价其抗炎活性。

36、7.通过对raw 264.7巨噬细胞表型的测定，评估其免疫调节作用。

37、主要研究步骤如下：

38、用脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞raw 264.7形成炎症模型，然后加入β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶继续孵育24小时后，采用免疫荧光染色法，对m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的表型进行定量，评价其免疫调节作用。

39、8.通过细胞安全性实验、体外溶血实验、皮肤刺激性实验以及小鼠肝心脾肺肾病理切片进行安全性评价。

40、(1)mtt方法评估加药培养24小时后的人类永生化表皮细胞(hacat)和人脐静脉血管内皮细胞(huvec)细胞存活率，评价药物的细胞毒性。

41、(2)β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶与大鼠红细胞共同孵育，用酶标仪测量各给药组在570nm的溶血率，评价药物的溶血性。

42、(3)将β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶涂抹在小鼠皮肤表面，24小时后取其皮肤，比较正常小鼠皮肤与给药小鼠皮肤病理情况，评价药物的皮肤刺激性。

43、(4)取给药12天小鼠的心、肝、脾、肺、肾的组织器官，比较正常小鼠与给药组小鼠组织的病理情况，评价药物的体内安全性。

44、本发明的具体研究结果阐述如下：

45、一、水凝胶的形成

46、发明人发现：β-d-五没食子酰葡萄糖在其浓度大于6mg/ml时，可以形成稳定的水凝胶；在浓度为4mg/ml时虽可以形成水凝胶，但具有较大的流动性，难以固定；而在浓度为2mg/ml时，则完全不能形成水凝胶。然而，其差向异构体α-d-五没食子酰葡萄即使将其浓度调高至20mg/ml时，也不能形成水凝胶。与此同时，与其结构类似的化合物如单宁酸和鞣花酸也不能自组装形成水凝胶。

47、综上所述，小分子水凝胶的形成具有不可预知性，需要综合考虑到化合物的结构、手性、位阻以及浓度等因素。并且，本发明的超分子水凝胶化合物，具有可注射性、热敏性、自愈合性以及稳定性等优良的凝胶性质以及表现出较好的流变性能，在频率与剪切应力的变化下，储能模量均大于损耗模量。

48、二、水凝胶的抗菌、抗氧化和抗炎治疗效果

49、体外实验中，β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶的抑菌效果见实施案例4表1；抗氧化效果见实施案例7表2和表3；抗炎效果见实施案例8表4。其中，该超分子水凝胶具备选择性抑菌能力，在选择性杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等致病菌的同时，不影响肠道内益生菌：枯草芽孢杆菌、屎肠球菌的活力。扫描电镜结果也显示，β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶能破坏细菌细胞壁结构，促进菌体变形裂解，进而也具有显著的抑制生物膜能力。此外，该超分子水凝胶还具良好的抗炎和抗氧活性，且均优于临床一线用药(地塞米松和抗坏血酸)。

50、动物体内实验中，在12天的治疗期间内，不同时间点β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶组的皮肤再生速度均大于感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌组(mrsa)组与空白对照组(control组)。12天后组织病理学切片表明β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶组切片与正常皮肤相似，表皮层与真皮层结构分明，有较多毛囊生长，较少的炎症因子、较多的胶原纤维沉积；而mrsa组的皮肤还在愈合之中，可见肉芽组织，并且未见毛囊恢复，还有较多的炎症因子，胶原纤维沉积量较少。12天后β-d-五没食子酰葡萄糖超分子水凝胶组炎症因子tnf-α、il-6明显低于mrsa组，具有显著的抗炎能力。

51、结合上述内容可知，与现有技术相比，本发明有如下优点：

52、本发明中，β-d-五没食子酰葡萄糖在不需要进行任何结构修饰和前处理以及无需借助任何辅料载体成分的条件下，可以自组装直接形成超分子水凝胶。直接利用小分子成分自组装形成水凝胶，可以直接达到传统药物分子和生物医药功能材料相结合的作用，避免了传统高分子聚合物水凝胶的制备工艺复杂性，以及其载药能力差和潜在高毒性等缺点。本发明打破了既往小分子水凝胶结构类型单一，且往往需要借助高分子材料成胶的瓶颈；创新性提出“传统药物分子+生物医药材料功能”的设计理念，指导具有生物医药材料的超分子水凝胶新药研发！