一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法

本发明属于骨修复材料，具体涉及一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法。

背景技术：

1、可注射骨修复材料是骨修复材料中用量较少，使用场景特殊的非主流产品；可注射、任意塑形或自固化等为其显著的外在特征。作为骨修复材料的一种，其构建依然遵循骨生成，骨传导及骨诱导机制。

2、在所有骨修复材料中，自体骨因同时具备骨生成、骨传导和骨诱导机制而成为“金标准”；同种异体或动物骨经一定处理后主要以骨传导机制完成骨修复，个别产品具有弱的骨诱导能力，因此，市场上同种异体骨因成分本就是人骨或者异种骨成分最为接近人骨而成为主流产品；人工骨如生物陶瓷、生物活性玻璃、硫酸钙类等无机材料仅具骨传导能力，只有复合骨生长因子如骨形态发生蛋白(bmp)后才兼具骨诱导能力，这类无机材料类人工骨因仿生程度较低，材料降解与新骨生成匹配不佳、骨修复能力较差而市场份额小。

3、现有的可注射骨修复材料主要存在以下不足或者缺陷：1)为了实现“可注射”、“可塑形”、“可固化”而添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料，成分复杂，仿生程度低。2)产品仅具骨传导能力，无骨诱导或者骨诱导能力极弱。3)产品多由粉体(固相)和专用固化液(液相)双相组成，使用时临时调制，使用便捷性差；因此，研发一种新型的可注射骨修复材料仍然是现阶段研发人员主要攻克的主题之一。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法；

2、本发明的目的还在于提供一种采用上述制备方法制得的可注射凝胶样骨诱导修复材料。

3、鉴于此，本发明采用的技术方案是：一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：

4、s1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备

5、将新鲜天然骨碎成200-500μm的骨粉，并对所述骨粉进行脱细胞去抗原处理，得到脱细胞去抗原冻干骨粉；

6、s2、骨胶原的提取

7、称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，并采用“酸+酶”法提取出骨胶原；

8、s3、可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备

9、称取一定量的s2得到的骨胶原，依次加入盐酸、氢氧化钠和pbs缓冲液，得到骨胶原溶液；

10、称取一定量的s1得到的所述脱细胞去抗原冻干骨粉加入至所述胶原溶液中，再向所述胶原溶液中加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到骨粉混合物；

11、对所述骨粉混合物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。

12、进一步地，所述s1中进行脱细胞去抗原处理的具体方法为：

13、s1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌8～12min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；

14、s1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理2～6h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；

15、s1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35～40℃下搅拌1～3h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为100～300rpm；

16、s1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至ph值为7.3～7.5，再预冻冻干处理。

17、进一步地，所述s1-1中，所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：(8～12)。

18、进一步地，所述s1-2中，所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：(0.8～1.2)；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1:(4～8)。

19、进一步地，所述s1-3中，所述脱细胞溶液为包含0.03～0.08％胰蛋白酶、3.5～4.5mm碳酸氢钠及0.2～0.7mm依地酸四钠edta的hank’s平衡盐溶液。

20、进一步地，所述s2的具体方法为：

21、s2-1、称取一定量的s1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：90～120ml盐酸：80～120mg胃蛋白酶的比例搅拌混合90～100h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；所述盐酸的浓度为0.008～0.012m；

22、s2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，离心分离，弃去上清液收集沉淀，并用醋酸溶解沉淀，得到酸酶处理后的骨粉；

23、s2-3、对所述酸酶处理后的骨粉进行透析处理，得到骨胶原。

24、进一步地，所述s2-2中，所述离心分离时的转速为10000～15000r/min，离心分离的时间为15min；所述醋酸的浓度为0.008～0.015m。

25、进一步地，所述s3的具体方法为：

26、s3-1、称取一定量s2得到的骨胶原，加入浓度为0.008～0.012m的盐酸，得到胶原含量为80～120mg/ml的骨胶酸液；

27、s3-2、向s3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.008～0.012m的氢氧化钠和ph＝7.4的pbs缓冲液，得到骨胶原溶液；

28、s3-3、向s3-2得到的骨胶原溶液中加入s1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；

29、s3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。

30、进一步地，所述s3-3中，所述天然提取的骨形态发生蛋白通过如下方法获得：

31、称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，依次采用水洗、脱钙、脱蛋白的工艺提取出骨形态发生蛋白，具体方法为：

32、叠氮钠水洗：称取一定量的s1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入浓度为2～5mm的叠氮钠水溶液，搅拌混合8～12min，重复上述工序至少三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；

33、盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入浓度为0.4～0.8mol/l的盐酸，搅拌混合均匀，并在2-8℃的条件下冷冻处理，将结块骨粒打碎，加入浓度为0.4～0.8mol/l的盐酸溶液搅拌20～25h，再加入浓度为2～5mm的叠氮钠水溶液搅拌1～3min，更换等量叠氮钠水溶液再次搅拌，如此反复至少三遍，得到盐酸脱钙后的骨粉液；

34、氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入氯化钙溶液，在2-8℃的条件下冷冻处理，再中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；氯化钙溶液的浓度为1.8～2.2mol/l；

35、一次水洗：用双蒸水洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；

36、edta脱蛋白：向所述一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入edta溶液继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉edta溶液，得到edta脱蛋白后的骨粉；

37、二次水洗：用双蒸水洗涤所述edta脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入edta脱蛋白后的骨粉；

38、氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入edta脱蛋白后的骨粉加入浓度为6～10mol/l的氯化锂继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；

39、一次水浴：用双蒸水洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2～6h，得到水浴加热后脱蛋白后的骨粉；

40、尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入浓度为3～9mol/l尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，并冷冻处理，得到尿素抽提处理后的骨粉液；

41、超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；

42、一次透析：将s3-10中的浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；s3-12、二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴0.8～1.2h；

43、离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：2～6℃，30000～50000g，30～40min；

44、二次纯化：离心处理后的骨粉用浓度为4～8mol/l的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15～25℃、转速为3000～4000r/min的条件下离心30～40min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；

45、二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入透析膜内，在柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；

46、二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：15～25℃，30000～50000g离心1～2h；

47、干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分、干燥处理，得到天然提取的骨形态发生蛋白。

48、进一步地，所述s3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述天然提取的骨形态发生蛋白含量为30～50mg。

49、进一步地，所述s3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述基因重组的骨形态发生蛋白含量为3～8mg。

50、本发明的另一个技术方案是这样实现的：一种可注射凝胶样骨诱导修复材料，采用上述的制备方法制得。

51、与现有技术相比，通过采用本发明方法，不仅避免了通过添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料来实现可注射、可塑形、可固化的问题，而且还解决了仅具有骨传导能力且无骨诱导或者骨诱导能力极弱的问题，同时还避免了使用时需要临时调制的问题，从而有效的提升修复材料的便捷性；此外，本发明制备方法得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力。