一种肺炎球菌结合物组合疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物制品制备，具体地说，涉及了一种肺炎球菌多糖蛋白结合物组合疫苗及制备方法，本发明制备的26价肺炎球菌结合疫苗用于肺炎球菌感染的免疫预防和诊断治疗。

背景技术：

1、肺炎球菌性疾病是全球严重的公共卫生问题之一，其病原体肺炎球菌定植于鼻咽部，通常不引起临床症状。当定植的环境发生变化，如机体抵抗力下降、麻疹或流行性感冒(流感)等呼吸道病毒感染、营养不良或年老体弱等情况下，肺炎球菌将透过黏膜防御体系发生侵袭性感染。大约75％的侵袭性肺炎球菌性疾病例(ipd)和83％的肺炎球菌脑膜炎发生在2岁以下儿童(who立场文件2019版)。2岁以下儿童是最容易感染肺炎球菌病的人口，其病死率特别高。

2、肺炎链球菌分泌荚膜包围在细胞壁外面，荚膜是肺炎链球菌主要毒力因子。根据荚膜的不同将肺炎球菌分为近100个血清型，优势血清型的分布在各个时期、各个地区都会有差异。

3、肺炎球菌疫苗是预防肺炎球菌感染的最有效手段，目前已上市的疫苗为肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine，ppv)和肺炎球菌结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine，pcv)。上世纪80年代时，惠氏公司(2009年被辉瑞收购)生产的23价肺炎球菌多糖疫苗(ppv23)对优势血清型的免疫覆盖率可以在全球各个洲都达到90％左右。但肺炎球菌荚膜多糖是胸腺非依赖性抗原(ti)抗原，不能在<2岁儿童中诱导有效的免疫应答，而该年龄段人群是肺炎球菌感染的高危人群。肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗可在婴儿2月龄时开始接种，全程3～4剂，可促进较强的免疫反应和记忆反应，是能够更快、更早地预防肺炎球菌的有利免疫方法。研究表明，结合疫苗可用于任何年龄段人群，接种效果也较多糖疫苗更长效持久，因此，多糖疫苗被结合疫苗替代成为肺炎球菌疫苗的发展趋势。全球首个上市pcv是惠氏公司生产的pcv7(prevnar 7)，于2000年获得fda批准。2010年能覆盖更多型别的pcv13(prevnar 13)上市，取代prevnar 7用于儿童常规疫苗接种。目前已通过who预认证的pcv共3个，gsk公司pcv10(synflorix)，辉瑞公司pcv13(prevenar 13)以及印度血清所pcv10(pneumosil)。2021年fda先后批准更高价次pcv上市，包括辉瑞公司prevnar 20(pcv20)和默沙东公司vaxneuvance(pcv15)。国内上市肺炎球菌多糖结合疫苗沃森生物的pcv13和民海生物的pcv13。

4、目前已上市的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，主要方法有两种：胺还原法和氰基活化法，(1)还原胺法。多糖经过高碘酸钠氧化，形成的醛基或酮基与载体蛋白的活性氨基反应，形成c＝n双键，经被还原剂还原成c-n单键，形成稳定的共价连接。(2)氰基活化法。通过溴化氰(cnbr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(cdap)在多糖上引入氰基，再与蛋白primary-nh2形成共价键。随着结合技术的发展，以这两种结合方法为基础，发展出了一些新的结合手段例如在多糖和蛋白间引入分子臂己二酸二酰肼(adh)，促进多糖和蛋白的结合，或者引入新的连接基团，促进结合反应的发生。

5、但文献报道，在进行多糖蛋白结合反应之前，对多糖的分子大小进行一定程度的降解。常见的降解方法有物理降解、化学降解和酶降解法。物理降解一般包括微波法、辐射法、超声降解法和高压均质仪剪切法，化学降解包括酸水解、碱水解和过氧化氢降解，酶降解法利用专一性或非专一性酶降解多糖。

6、cn108079286a“一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用”公开了对于分子大小在sepharose cl-4b柱上检测kd值＜0.20的肺炎球菌荚膜多糖，在活化、衍生前采用超声波降解或70-85℃高温水解工艺将多糖分子大小降低到在sepharosecl-4b柱上检测kd值为0.20-0.50之间。

7、cn109862908b“多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物”公开了氢氧化钠、盐酸、冰醋酸在高温条件下进行水解的方法。

8、cn107810010a“多价肺炎球菌结合疫苗”公开了采用高压均化器降低多糖的分子尺寸。

9、cn103830723a“一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法”公开了多糖在冰水浴中，用功率为80-100w，频率为20-40khz的超声波处理溶液。

10、多糖抗原性是免疫反应性和免疫原性的一个重要指标。多糖相对分子质量越大，抗原性越强，相对分子质量的降低可能伴随着抗原性的损失。事实证明，每种多糖降解方法在降低多糖分子大小的同时，都会破坏多糖的特异基团和抗原表位，而且导致降解多糖的质量属性批间差异大。

技术实现思路

1、本发明克服了上述多糖抗原性损失的问题，本发明采用经菌种发酵、多糖纯化收获的精制多糖，在多糖蛋白结合工艺中精制多糖不经过任何降解处理，直接进行多糖活化、结合反应。这种使用天然纯化的肺炎球菌多糖有效的保护了多糖的抗原性。本发明进行连续三批结合物原液和疫苗的生产，多糖收率和各项检定指标稳定，证实本发明工艺稳定。

2、本发明的目的在于提供一种26价肺炎球菌结合物组合疫苗。

3、本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗基于肺炎球菌的荚膜多糖，涵盖了导致肺炎球菌病的最常见血清型。本发明在原有23价肺炎球菌多糖疫苗(血清型有1、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f共23个)的基础上，增加了6a、24f和35b三个血清型，其中6a型是13价肺炎结合疫苗pcv13中的血清型，24f和35b这两个血清型是非疫苗血清型引起的侵入性肺炎球菌病增加趋势较为显著的两个血清型。据文献报道，近年来，血清型24f受到广泛关注，在耐药性侵入性肺炎球菌病病例中尤为常见。德国、英国、西班牙、丹麦、日本等多个国家均报道24f血清型导致的侵入性肺炎球菌病病例数在逐年增加。35b血清型导致的侵入性肺炎球菌病近年来明显增加。23个原有血清型的免疫覆盖率可以在全球各个洲都达到90％左右，本发明再加上3个新增血清型，扩大了免疫保护范围，覆盖率远超90％。

4、本发明技术方案如下：26价肺炎球菌结合物组合疫苗，包括26种肺炎球菌血清型，结合物由相应血清型的肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白破伤风类毒素通过化学共价结合方法制备的多糖蛋白结合物，26种多糖蛋白结合物原液再与铝佐剂按适当比例吸附后获得肺炎球菌结合疫苗。

5、进一步地，本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗包括1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、33f和35b共26种血清型。

6、在23价肺炎球菌多糖疫苗的基础上，增加了6a、24f和35b三个血清型，免疫覆盖率远超90％。

7、其中，除了2型和3型以外的肺炎球菌荚膜多糖采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(cdap)活化后，以己二酰肼(adh)为间隔剂形成衍生物，再与载体蛋白tt在碳二亚胺(edac)作用下生成多糖蛋白结合物；

8、其中，2型和3型多糖采用cdap活化后，直接与tt结合生成多糖蛋白结合物。

9、其中，疫苗中还含有佐剂，佐剂是铝佐剂，铝佐剂是磷酸铝佐剂。

10、本发明的另一个目的在于提供26价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法。

11、本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗，肺炎球菌多糖和tt通过氰基活化法共价结合制备多糖蛋白结合物，其中2型和3型多糖采用直接结合法，即多糖经cdap活化后，直接与tt结合生成多糖蛋白结合物，其他血清型肺炎球菌多糖采用先衍生后结合的方法，即多糖经cdap活化后，以己二酰肼(adh)为间隔剂形成衍生物，再与载体蛋白tt在碳二亚胺(edac)作用下生成多糖蛋白结合物。所述制备方法如下：

12、步骤1：所述肺炎球菌多糖经菌种发酵后，去除菌体后，多糖纯化工艺采用ctab沉淀、氯化钠解离、羟基磷灰石层析、最后冻干，获得精制肺炎球菌多糖；

13、步骤2：1、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、33f和35b型肺炎球菌多糖采用cdap活化后，以adh为间隔剂进行衍生反应，经超滤纯化后形成多糖衍生物，再与载体蛋白tt在edac作用下进行缩合反应，经超滤得到多糖蛋白结合物；

14、其中，cdap：多糖质量比为0.1～1.0，优选的，8、9n、9v、10a、20、33f和35b为0.1～0.5，其他型0.5～1.0；

15、其中，adh终浓度为0.2mol/l；

16、其中，反应过程ph8.0～9.0；

17、其中，反应时间不少于2小时。

18、步骤3：2型和3型多糖采用cdap活化后，直接与tt进行结合反应，经超滤得到多糖蛋白结合物；

19、其中，cdap：多糖质量比为0.1～1.0，优选为0.25～0.75；

20、其中，多糖：载体蛋白tt质量比为1:0.5～1:2，优选为1:1～1:2；

21、其中，反应过程ph8.0～9.0，

22、其中，反应时间不少于2小时。

23、步骤4：多糖蛋白结合物经sepharose 4ff层析，收集v0附近、kd 0.2以前的组分即为纯化的结合物，除菌过滤后即为肺炎球菌多糖蛋白结合物原液；

24、步骤5：将26个型多糖蛋白结合物原液混匀后加入吐温80、磷酸铝佐剂、氯化钠溶液，灌装后为26价肺炎球菌结合物组合疫苗。

25、进一步地，精制肺炎球菌多糖大部分型别重均分子量mw在300～800kda，2型和7f型mw在900～1200kda，18c、19a和19f型mw在100～400kda。其中除6a、24f和35b型以外，其他23个型精制多糖质量符合2020年《中华人民共和国药典》中“23价肺炎球菌多糖疫苗”中多糖质量标准，6a、24f和35b型精制多糖质量符合批准的要求。

26、进一步地，1、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、33f和35b型肺炎球菌多糖衍生物的衍生率(adh的含量)为1％～10％。通过衍生反应中cdap的加入量以及其他反应参数的控制，来控制adh的含量，避免了多糖蛋白结合物的过度交联，保证层析纯化和除菌过滤的顺利进行。

27、本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗，分别称取26种多糖蛋白结合物原液加入吐温80溶液搅拌均匀。将混合原液磷酸铝佐剂混合，吸附过夜。将上述半成品在分装至无菌的1ml预灌封注射器内，灌装后即为成品。

28、进一步地，疫苗的ph为5.0～7.0，铝离子含量为0.15～0.35mg/ml，钠离子含量为7.5～9.5g/l，吐温80含量120～180μg/ml。

29、进一步地，单位剂量的组合疫苗中，各型肺炎多糖的含量为2.2μg±30％，6b为4.4μg±30％，每剂疫苗含量为0.5ml。

30、根据实施例之一，2型和3型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的制备

31、称取多糖1g，加入100mg/ml cdap乙腈溶液(cdap：多糖质量比为0.10～0.75)活化后，同时加入三乙胺水溶液维持ph 8.0～9.0，加入载体蛋白(多糖：蛋白投料比为1:1～1:2)，维持ph8.0～9.0，反应时间不小于2小时，经超滤或透析得到多糖蛋白结合物。

32、根据实施例之一，2型和3型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的制备

33、除2型和3型外，其他24型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的制备

34、称取多糖1g，加入100mg/ml cdap乙腈溶液(cdap：多糖质量比为0.10～0.75)活化后，加入三乙胺水溶液调至ph 8.0～9.5，维持ph范围8.0～9.5，加入等体积adh溶液至终浓度为0.2mol/l，维持ph范围8.0～9.0，反应时间不小于2小时，超滤纯化后获得多糖衍生物。多糖衍生物与载体蛋白混合，加入edac溶液至终浓度0.02mol/l，维持ph5.6左右，反应时间不小于2小时，经超滤纯化得到多糖蛋白结合物。

35、根据实施例之一，26价肺炎球菌结合疫苗的制备

36、按照每剂疫苗各型肺炎多糖的含量为2.2μg±30％，6b为4.4μg±30％，分别称取26种多糖蛋白结合物原液加入吐温80溶液搅拌均匀；将混合原液磷酸铝佐剂混合，吸附过夜；其中铝离子含量为0.15～0.35mg/ml，钠离子含量为7.5～9.5g/l，吐温80含量120～180μg/ml。

37、将上述半成品在分装至无菌的1ml预灌封注射器内，灌装后即为成品，每剂疫苗含量为0.5ml。

38、本发明的另一个目的在于提供疫苗在制备预防或治疗肺炎的药物中的应用。

39、本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗临床前动物实验结果显示具有良好的安全性和免疫原性，并与已上市的13价肺炎球菌结合疫苗对比，26个血清型均能刺激小鼠产生高水平滴度的抗体。

40、与现有的肺炎球菌结合物组合疫苗相比，本发明具有以下有益效果：

41、(1)本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗在多糖蛋白结合工艺中使用的精制多糖不经过任何降解处理，直接进行多糖活化、结合反应。这种使用天然纯化的肺炎球菌多糖有效的保护了多糖的抗原性。本发明进行连续三批结合物原液和疫苗的生产，多糖收率和各项检定指标稳定，证实本发明工艺稳定。

42、(2)通过衍生反应中cdap的加入量以及其他反应参数的控制，来控制衍生率，避免了多糖蛋白结合物的过度交联，保证层析纯化和除菌过滤的顺利进行。

43、(3)利用速率比浊法对肺炎球菌多糖、结合物及其制备过程中间品进行抗原性监控，进行抗原性分析，为肺炎球菌多糖蛋白结合工艺路线的选择提供了参考依据。最大程度地避免破坏疫苗原液中抗原的特异性表位，保护了抗原的完整性。

44、(4)临床前动物实验结果显示本发明26价肺炎球菌结合物组合疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并与已上市的13价肺炎球菌结合疫苗对比，13个血清型的抗体滴度不劣于13价肺炎球菌结合疫苗中相同血清型的抗体滴度，其他13个血清型也均能刺激小鼠产生高水平滴度的抗体。

45、本发明所用原料都可以在市场上购买到，或者根据现有技术的方法制备得到。

46、多糖和载体蛋白tt为本公司根据现有方法制备得到，所用菌种购自中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心。主要化剂购自sigma公司。

47、对于说明书中出现的英文缩写或者技术名词作出进一步的解释：

48、ctab：hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可用来沉淀多糖。

49、cdap：1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐，cdap可用来活化多糖。

50、adh：adipoyl hydrazide，己二酸二酰肼，简称己二酰肼。adh是一种优良的偶联剂，可与醛基等化学交联。

51、载体蛋白tt：tetanus toxoid，破伤风类毒素，本品系用产毒力强的破伤风梭菌，接种于适宜的培养基培养，产生的外毒素经甲醛溶液灭活脱毒、除菌过滤后制成，在结合疫苗中常用作载体蛋白。

52、edac：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。

53、sepharose 4ff：sepharose 4fast flow，一种凝胶过滤层析填料。它是以多孔性凝胶填料为固定相，凝胶过滤层析按分子大小顺序分离各个组分的液相色谱方法。

54、v0：外水体积，是指层析柱中凝胶颗粒间液体流动相的体积，由于大分子物质不进入凝胶颗粒内部，而只存在于凝胶颗粒间的流动相中，其洗脱体积等于v0。多糖蛋白结合物就属于这种大分子物质，因此在凝胶层析中收集v0附近洗脱峰。

55、羟基磷灰石(cht)：ceramic hydroxyapatite，陶瓷羟基磷灰石，是一种具有重要应用价值的羟基化合物复合模式层析介质，外观呈球形，具有超大孔径，分为cht i和chtii两种类型。