内外同源载药外泌体样纳米囊泡及制备方法和应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种内外同源载药外泌体样纳米囊泡及制备方法和应用。

背景技术：

1、植物释放外泌体样纳米囊泡(exosome-like nanovesicles，ens)，是一类直径在30-150nm的细胞外囊泡，具有磷脂双分子层结构，含有mirna、生物活性脂质、mrna和蛋白质，可发挥抗氧化、抗炎和组织再生活性。ens作为细胞外信使，刺激细胞间的通讯和对病理疾病的生物防御。近年来，ens作为药物输送系统在各种治疗中得到了广泛的探索，不仅安全、生物相容性良好和可生物降解。研究表明，药源性植物外泌体样纳米囊泡作为细胞间通讯的重要媒介，在药源性植物发挥疗效过程中扮演着重要的角色。与其他来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)相比，药源性植物细胞外囊泡中包裹了其同源中药植物的药效物质，表现出明显的药理活性，对于溶解性较差的活性成分，可以极大地提高其生物利用度。对药源性植物来说，ens提取制备过程未使用有机溶剂和破坏性分离方法,较好保留了原生中药多成分、多途径起效的的协作关系。

2、ens具有生物相容性高、免疫原性低等特点，其磷脂双分子层结构可以保护内容物不被快速分解。植物外泌体的脂质双分子层结构，使得其成为运载疏水/亲水药物和活性成分的药物递送载体。

3、冬凌草甲素(oridonin，ori)是从传统中草药冬凌草分离出来的一种贝壳杉烷型四环二萜类天然生物活性物质，如冬凌草甲素、乙素、丙素等，这些成分具有抗菌、抗炎、抗癌等多种生物活性，临床用于口腔炎症及癌症的辅助治疗。有研究发现nlrp3炎症小体是ori的直接靶点，ori特异性抑制nlrp3的激活。而且表明ori或其类似物可能具有治疗nlrp3驱动的疾病，特别是慢性疾病的潜力。并且ori可抑制nf-κb或mapk的激活，从而抑制促炎细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子tnf-α和白细胞介素il-6。冬凌草来源ens包含其源植物的mirna、生物活性脂质、mrna和蛋白质，可发挥抗氧化、抗炎作用，同时ens作为细胞外信使发挥刺激细胞间的通讯，ens与冬凌草主要提取活性物ori联用，可起到增强ori药理活性作用。特别是ens作为药物载体包载ori不仅可克服ori溶解性缺点，还可发挥药物缓释及体内有效递送优点，外层的载体ens和ori均来源于冬凌草，发挥协同增强ori药理活性作用。

4、目前，外泌体载药策略可分为内源装载(endogenous)和外源装载(exogenous)两大类，内源装载指的是分离ens之前将药物分子装载到亲本细胞中，使其分泌的ens携带药物分子。而外源装载指的是先提取纯化ens，再通过被动或主动方式将药物分子直接装载到ens膜表面或腔内。

5、内源装载不会损伤ens膜，最常采用的方法为转染(transfection)和共孵育(co-incubation)，例如，构建融合表达特定蛋白和外泌体膜蛋白的质粒，通过转染等方式，让融合蛋白在ens来源细胞中大量表达，这些细胞产生的ens携我们想要的蛋白。共孵育法指的是让待装载的分子与外泌体在一定条件下充分接触，依靠外泌体膜本身的疏水性被动完成装载的过程。共孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，主要适用于小分子疏水物质(例如姜黄素)，装载效率受药物浓度影响，所需时间较长。然而，内源装载往往无法控制evs装载药物的数量。

6、相比内源装载，外源装载操作简单，批次间的稳定性更高，更适合放大化生产。目前，外源装载的常用方法有孵育、电穿孔、超声、借助化学药物等。超声法是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而允许小分子物质扩散到外泌体中。超声法主要用于装载亲水分子，装载后有些小分子物质也会附着于外泌体膜外侧，其对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂，且实验重复性较差。

7、本领域技术人员做了诸多研究，通过对比其他专利，例如专利cn115678826a中使用蔗糖密度梯度超速离心法提取冬凌草外泌体，离心10-12h。专利文献cn114015640a中使用微滤中空纤维柱进行除杂，通过超滤中空纤维柱进行浓缩，获得所述植物来源外泌体，其前期震荡时间18-48h。专利文献cn111139215a，采用浸泡加抽真空的提取方法来制备外泌体，但该方法不利于量产。专利文献cn111905107a中通过孵育并反复离心的方法让芦荟外泌体样纳米囊泡装载阿霉素，孵育后通过反复超速离心得到载药外泌体样纳米囊泡，同样存在装载效率不高的技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种内外同源载药外泌体样纳米囊泡及制备方法和应用。

2、本发明的第一方面，提供一种内外同源载药外泌体样纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：

3、以冬凌草叶子为原料提取冬凌草外泌体样纳米囊泡；

4、将冬凌草外泌体样纳米囊泡溶液与冬凌草甲素溶液混合，挤压混合液，并通过孔径为200～800nm的聚碳酸酯膜，使冬凌草甲素负载于冬凌草外泌体样纳米囊泡内。

5、作为本发明所述制备方法的优选，所述冬凌草外泌体样纳米囊泡溶液浓度为0.5～5mg/ml，冬凌草甲素溶液浓度为0.2～1.2mg/ml。

6、作为本发明所述制备方法的进一步优选，所述冬凌草外泌体样纳米囊泡溶液与冬凌草甲素溶液的体积比为0.5～2.5：1。

7、本发明的第二方面，提供由所述所述制备方法制备得到的内外同源载药外泌体样纳米囊泡。

8、本发明的第三方面，提供所述内外同源载药外泌体样纳米囊泡在制备治疗结肠癌的药物中的应用。

9、本发明的第四方面，提供所述内外同源载药外泌体样纳米囊泡在制备细菌抑制剂或由所述细菌引起疾病的治疗药物中的应用。

10、本发明的第五方面，提供所述内外同源载药外泌体样纳米囊泡在制备促进m1型巨噬细胞向m2型转化的药物中的应用。

11、本发明的第六方面，提供所述内外同源载药外泌体样纳米囊泡在制备炎症抑制剂中的应用。

12、本发明的第七方面，提供一种药物，所述药物以所述内外同源载药外泌体样纳米囊泡作为有效成分，所述药物具有如下功能：

13、治疗结肠癌；

14、抑制大肠杆菌和金黄色葡糖球菌；

15、治疗由大肠杆菌和/或金黄色葡糖球菌引起的疾病；

16、促进m1型巨噬细胞向m2型极化；

17、抑制炎症。

18、本发明具有如下有益效果：

19、发明人在研究过程中，意外的得到了一种装载同源药物的方法：利用脂质体挤压器将冬凌草甲素与ens混合在一起反复挤压，冬凌草ens包载ori，构建内外同源、表里相合的载药外泌体样纳米囊泡ori/ens。与现有技术相比，本发明优点在于：这种装载药物的方法不仅保留了ens的完整性，提高了药物装载的效率，且同源药物和外泌体样纳米囊泡的结合对疾病的治疗起到联合放大或协同增强的作用，实验步骤及时间也大大缩减，为ens载药提供了新的思路。