MDL-800在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的应用

本发明属于生物医学，尤其涉及mdl-800在小鼠心肌缺血再灌注中的应用。

背景技术：

1、心肌梗死(myocardial infarction,mi)，是指心肌的缺血性坏死，在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持续性地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死。急性心肌梗死是严重威胁人类健康和生命的疾病，在急性心肌梗死发作后的几分钟内,缺血中央区的心肌细胞便会由于缺血缺氧而死亡,其全球发病率、致残率和死亡率也很高。然而如何改善心肌缺血引发的心肌梗死，正在引起全世界范围的广泛关注和研究。目前改善mi最有效的方法是尽快恢复缺血心肌的血流,即缺血再灌注。及时有效的缺血再灌注能挽救大约30％患者的生命。临床上通常采用溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成型术、动脉搭桥术、心脏外科体外循环等方法。

2、心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,mi/ri)是指心肌在短时间内血供中断,恢复血供后一定时间内,原缺血心肌会发生较血供恢复前更为严重的损伤。一般认为缺血的组织、器官在可逆损伤以前得到再灌注便可存活并恢复,但发现在有些情况下,经过一定时间缺血的组织器官并未发生明显的功能结构改变,在得到血液再灌注时却发生了不可逆性的损伤。有研究表明已经发生严重的缺血性损伤的细胞,再灌注并不使其损伤减轻,反而会加速细胞的死亡。在缺血引起的心肌细胞损伤中,心肌细胞代谢率明显降低,组织出现缓慢但较为明显的损伤。如果在缺氧基础上再复氧,这种损伤就会加快、加重。尽管再灌注重新提供给组织细胞氧及营养物质,但这种再复氧反而加速机体损伤是因为再复氧的同时也促进氧自由基释放。再灌注在机体多种病理、生理改变中发挥重要作用,缺血后再灌注将导致更严重的后果。研究发现,有多种因素在缺血再灌注损伤机制中发挥重要作用,缺血后再灌注将导致更严重的后果。研究发现,有多种因素在缺血再灌注损伤机制中发挥重要作用,包括炎症过程、氧自由基损伤、钙超载、氧化应激等。

3、心肌缺血/再灌注损伤的防治工作已经引起了全球范围内医生、学者和科研工作者的高度重视和广泛关注。随着血管再通技术如经皮冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路移植术的广泛开展，直接心肌梗死率降低，但再灌注损伤相应增多，目前尚缺乏有效药物治疗，临床上acei/arb类药物或β受体阻滞剂可以在一定程度上改善心肌梗死患者血管再通后的预后，但仍不能满足临床需求，进一步开发改善心肌梗死患者血管再通后预后的药物仍然是目前研究的重点。既往基础研究实验表明hdac6在多种肿瘤组织中低表达，且被证实发挥重要的肿瘤抑制作用，因此针对hdac6的药物开发不断的改进。mdl-800作为新开发的i类hdac6小分子激动剂，使hdac6介导的组蛋白h3去乙酰化增加，从而抑制组蛋白h3乙酰化带来的诸多不良效应。hdac6在多种疾病的病理过程中发挥重要作用，在一项公布号为cn112972453a的中国发明专利中公开了mdl-800在在制备抑制sarscov2病毒易感性药物中的应用，说明了mdl-800能降低sars-cov-2病毒的感染风险。但是hdac6的激动剂mdl-800在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚无报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种mdl-800在小鼠心肌缺血再灌注中的应用。

2、本发明是这样实现的，一种mdl-800在小鼠心肌缺血再灌注中的应用，通过构建小鼠缺血再灌注的模型，再灌前15min腹腔注射mdl-800，通过伊文思蓝/ttc染色对各组小鼠进行心肌梗死面积检测，通过马松染色对各组小鼠进行心肌瘢痕纤维检测，验证mdl-800在在小鼠心肌缺血再灌注中的作用，包括：

3、步骤一，采用的mdl-800为市面新开发的i类hdac6小分子激动剂，来源于市场购买，动物采用c57bl/6j小鼠；

4、步骤二，心肌缺血再灌注动物模型；

5、步骤三，再灌前15min腹腔注射mdl-800；

6、步骤四，小动物超声检测小鼠心脏收缩功能；

7、步骤五，依文思蓝/ttc染色检测心肌梗死面积；

8、步骤六，马松染色对各组小鼠进行心肌瘢痕纤维检测。

9、进一步，所述心肌缺血再灌注动物模型：

10、术前准备：由matrix vip麻醉机将异氟烷与氧气的混合气体通过导管导入动物准备仓，对各组实验小鼠进行诱导吸入麻醉；麻醉满意后，将小鼠固定在手术台上，仰卧位，保持恒温，通过另一根导管将混合气体接小鼠口鼻部位，进行维持麻醉；

11、模型构建。

12、进一步，所述模型构建：

13、①术区备皮：对于手术后进行超声检测的小鼠，在术前应对小鼠胸部术区进行备皮，防止术后备皮造成手术切口裂开和感染；

14、②局部开胸：分辨小鼠胸骨位置，在其左缘3-4mm近心脏处，用剪刀剪开长约2-3cm的切口，切口方向与心脏长轴垂直，用止血钳适当分离胸壁结构，预先在切口周围用4-0的缝合线做一间断褥式外翻缝合口；

15、③暴露心脏：当完全分离胸壁后，用止血钳迅速刺穿胸壁，充分撑开胸部切口，协调进行左手按压及右手旋转止血钳，迅速将心脏挤压出胸腔外，找到左侧冠状动脉前降支；

16、④结扎血管：用6-0缝合线迅速结扎左侧冠状动脉前降支，打一活结，方便再灌注时去除缝合线，避免再次开胸；结扎后将心脏快速小心地送回胸腔，同时挤压胸壁尽量排出胸腔内气体；迅速收紧预留的皮肤缝合口，结扎切口，关闭胸腔；注意使结扎处活结的一部分露于切口皮肤下；假手术组：小鼠操作同手术组，只是在开胸暴露心脏后不结扎左侧冠状动脉前降支。

17、进一步，所述小动物超声检测小鼠心脏收缩功能：

18、检测前准备：在缺血再灌注模型建立前进行备皮，超声检测前一天对待检测小鼠胸部扩大脱毛，充分显露超声观察区；

19、麻醉：由matrix vip麻醉机将异氟烷与氧气的混合气体通过导管导入动物准备仓，对各组实验小鼠进行诱导吸入麻醉；麻醉满意后，用胶布将小鼠固定于检测台上，仰卧位，确保四肢在检测台的电极片上，同时涂上导电胶，维持检测台温度在37-40℃；通过另一根导管将麻醉用混合气体接小鼠口鼻部位，进行维持麻醉；记录小鼠心电活动、呼吸频率生理指标，控制小鼠心率在400-500次/分钟之间，稳定数分钟后开始进行下一步；

20、超声检测：在小鼠胸部涂上超声介质胶后，利用visual sonics vevo2100型小动物超声检测系统对各组小鼠进行m型超声检测；该检测系统的相关参数为测定频率为15mhz，深度为3cm，速度为200mm/s；为获取相对清晰的胸骨旁左心室短轴图像，可适当调整超声探头的方向及位置，于左心室乳头肌水平测定并记录相应m型超声图像；

21、统计分析：根据所记录的m型超声图像，用超声分析软件测量各组小鼠ejectionfraction(ef),fractional shortening(fs),stroke volume(sv),cardiac output(co)指标，检测需包括连续的6个心动周期。

22、进一步，所述依文思蓝/ttc染色检测心肌梗死面积：

23、染色溶液配制：用pbs溶液配制浓度为1％-3％的依文思蓝溶液及ttc溶液，依文思蓝溶液需过滤除去未溶解杂质，ttc溶液预先置于37℃水浴锅中；

24、血管内注入染料：构建心肌缺血再灌注模型后24小时，利用浓度为0.3％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，打开胸腔，暴露心脏，按原来结扎处再次结扎左侧冠状动脉前降支，用胰岛素注射器吸取适量依文思蓝溶液，自升主动脉根部迅速注入少量依文思蓝染料，待心脏供血区域均被依文思蓝染料覆盖后停止注射，心脏稍微搏动数下后取下心脏，置于干冰上；

25、心脏切片：待心脏冻结后，用刀片将心脏自心尖部开始切成2mm的心脏切片，一般切成5片，标准为伊文思蓝面积占整个切片的100％、75％、50％、25％、0％，迅速置于37℃ttc溶液中，孵育20min；

26、摄取图片：孵育完成后取出心脏切片，置于pbs溶液中，用微距相机摄取图片；每组选取5-6只小鼠；

27、图片分析：每张心脏切片由2种或3种颜色的区域组成，假手术组表现为2种颜色：蓝色、红色；手术组表现为3种颜色：蓝色、红色和白色；用imagej图像分析软件计算心肌梗死面积：危险区/心脏切片总面积，白色区域/危险区。

28、进一步，所述马松染色检测心肌纤维化程度：

29、马松染色步骤：①将心脏组织石蜡切片脱蜡至水；②harris’s苏木素染细胞核10min，流水稍洗；③0.1％盐酸酒精分化、水洗、返蓝、水洗；④masson复合染液染色10-20min，0.2％醋酸速洗15秒钟两次；⑤1％磷钼酸处理58min，0.2％醋酸速洗15秒钟两次；⑥1％亮绿sf染色24min，0.2％醋酸速洗15秒钟两次；⑦直接用新鲜95％酒精分化20-30min；⑧在使用无水酒精进行脱水处理及二甲苯进行透明处理后，用中性树胶将心脏石蜡切片封片，室温保存备用；

30、观察马松染色切片：应用普通光学显微镜(leica)观察摄取各组小鼠心脏马松染色切片；蓝色或绿色(用苯胶蓝液或亮绿复染)为胶原纤维，红色为胞质、肌纤维和红细胞，蓝褐色为胞核。每组选取5只小鼠。

31、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

32、第一、本发明主要通过构建心肌缺血再灌注模型，来阐明市面新开发的i类hdac6小分子激动剂mdl-800的心血管保护作用。据文献报道，mdl-800是sirt6的选择性变构激活剂，sirt6是sirt去乙酰化酶家族的成员，负责组蛋白h3k9ac和h3k56ac的去乙酰化，具有肿瘤抑制活性。mdl-800将sirt6的脱乙酰基酶活性提高了多达22倍，导致肝细胞癌(hcc)细胞中h3k9ac和h3k56ac减少，导致细胞周期停滞并抑制其增殖。它还抑制了肝细胞癌细胞系bel7405异种移植物的生长。然而在心血管疾病中的研究还未见报道，其具体作用和机制还尚未清晰。

33、本发明发现mdl-800明显改善心肌缺血再灌注后的心脏收缩功能，本发明通过构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，再灌前15min腹腔注射mdl-800(20mg/kg，dmso溶解，peg400加生理盐水稀释)，利用小动物超声检测系统对各组小鼠进行m型超声检测，结果表明，与假手术组相比，缺血再灌注组小鼠心脏收缩功能降低(fs、ef、sv、co均下降)，而给予mdl-800后小鼠心脏功能得到改善(fs、ef、sv、co均有所回升)。

34、本发明发现mdl-800明显改善心肌缺血再灌注后的心肌梗死面积，对于小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，再灌前15min腹腔注射mdl-800，通过伊文思蓝/ttc染色对各组小鼠进行心肌梗死面积检测，结果表明，缺血再灌注组小鼠心肌梗死面积明显增加，而给予mdl-800后显著缩小心肌梗死面积，而2组之间的缺血危险区无明显差异。

35、本发明发现mdl-800明显改善心肌缺血再灌注后的心肌瘢痕纤维，对于小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，再灌前15min腹腔注射mdl-800，通过马松染色对各组小鼠进行心肌瘢痕纤维检测，结果表明，缺血再灌注组小鼠心肌瘢痕纤维明显增多，而给予mdl-800后显著减轻心肌瘢痕纤维。

36、第二，本发明的技术效果和优点是：(1)mdl-800在心血管疾病中的应用还未见报道，具体作用和机制尚未清晰，本发明的研究具有一定的探索创新意义(2)mdl-800作为一种小分子激动剂在肝癌的研究中已经得到证实，其在防治mi/ir方面还未见研究报道，具有重要的研究价值和意义

37、第三，本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明的技术方案为研究mi/ir提供了一种新的方案，为治疗改善mi/ir提供了一种新的分子激动剂，为研究和治疗mi/ir补充了一种新的方案。

38、本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：本发明的技术方案从基础研究中发现了mdl-800在心血管研究中的新的作用，为研究和治疗mi/ir的技术难题提供了一种新的思路。

39、第四，mdl-800在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的应用带来的显著技术进步主要体现在以下几个方面：

40、1.新型心脏保护策略

41、mdl-800作为一种新开发的i类hdac6小分子激动剂，为心肌缺血再灌注损伤提供了新的治疗策略。与传统治疗手段相比，mdl-800通过特定的分子机制直接作用于心肌细胞，调节蛋白质的乙酰化状态，从而保护心脏免受缺血再灌注损伤。

42、2.心脏功能恢复的促进

43、mdl-800通过改善心肌细胞的存活率和减轻再灌注损伤，有助于心脏功能的恢复，尤其是在急性心肌梗死和长期心肌缺血再灌注模型中。这一技术进步不仅提高了治疗效果，还减少心脏疾病后的并发症，如心力衰竭和心肌纤维化。

44、3.心肌梗死面积的减少

45、通过应用mdl-800，心肌梗死面积显著减少，这意味着心脏受损的范围更小，心脏的结构和功能保留得更完整。这一点在伊文思蓝/ttc染色和心脏超声检测中得到了验证，说明了mdl-800在心脏保护方面的高效性。

46、4.心肌瘢痕纤维化的减轻

47、mdl-800减轻了心肌缺血再灌注后的瘢痕纤维化，这对于维持心脏的正常功能至关重要。瘢痕纤维化会导致心脏僵硬，影响其泵血能力，而mdl-800的应用显著降低了这一风险，这在马松染色中得到了体现。

48、5.心脏疾病治疗的潜在应用

49、mdl-800的成功应用在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，为其在人类心脏疾病，特别是心肌梗死和缺血性心脏疾病的治疗中的潜在应用奠定了基础。未来的临床研究进一步验证其安全性和有效性，为心脏疾病患者提供更多的治疗选择。

50、本发明提供的mdl-800在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的应用，展示了其在心脏保护、治疗心脏疾病方面的显著技术进步和潜在价值。