口腔来源间充质干细胞外泌体在制备预防和治疗肝脏疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学，尤其是涉及一种口腔来源间充质干细胞外泌体在制备预防和治疗肝脏疾病药物中的应用。

背景技术：

1、肝脏作为人体重大脏器之一，担负重要生理功能如：代谢功能、解毒功能、过滤功能、免疫功能、凝血功能、胆汁生成与排泄等。近年来各种不同诱因导致的肝损伤发病率居高不下，是国民生命健康的主要威胁，原因在于肝损伤会对身体造成广泛的影响，包括：恶心、呕吐，代谢营养紊乱导致的低血糖、高胆固醇、高脂肪，还会影响免疫系统的功能，造成感染及获得肿瘤的风险，严重时还会危及生命。

2、急性肝损伤(ali)是指由感染、缺血、毒物或药物使用不当等触发因素在短时间内引发的肝细胞变性、坏死，因其病情进展往往较快，可迅速发展为急性肝衰竭。由于急性肝衰竭发生机制复杂，在治疗及预防方面尚存诸多挑战。

3、除急性肝损伤(ali)可能发展为急性肝衰竭外，对于肿瘤侵犯的肝脏体积过大的中晚期肝癌患者，切除范围过大时极易导致术后肝衰竭的发生。肝切除术治疗肝细胞癌相关指南及专家共识明确指出，肝癌患者肝切除术后正常功能的肝脏至少保留20％-25％，肝实质显著损伤的患者包括肝硬化等情况，肝脏需保留40％以上，大量中晚期肝癌患者不能达到手术切除肿瘤的标准。因此，肝脏再生修复能力的障碍是限制包括肝癌在内的多种肝脏疾病治疗效果和预后的重要因素，然而目前临床上改善肝再生的手段和策略仍非常匮乏。

4、目前常用的治疗手段多为药物治疗和手术治疗，药物治疗根据肝损伤病程发展情况可通过止血药、保肝药、抗生素、营养补充等实施救治；手术治疗根据病程发展可包括肝脏病变组织清除、肝脏移植等手段。

5、但现有肝损伤的药物治疗难以实现靶向且高效的肝脏损伤修复，同时还会产生药物耐受性，长时间的药物治疗也会因药物及其代谢物对肝脏产生损伤。而且无论是经口或经静脉输注的药物，在体内都要经过全身血液循环才能到达受损组织，靶向性差，降低了药物的生物利用率，达不到有效治疗浓度，且易对非靶器官造成毒性。此外，手术肝脏移植治疗风险大，费用高，供体资源短缺，且可能出现移植后免疫排斥反应。

6、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种口腔来源间充质干细胞外泌体在制备用于预防和治疗肝脏疾病药物中的应用。经申请人研究发现，口腔来源间充质干细胞外泌体相对于其他来源的间充质干细胞外泌体在药物性急性肝损伤和85％大范围肝切除术后导致的肝衰竭的防治过程中，具有更为明显的治疗和改善效果。

2、本发明的第二目的在于提供一种预防和治疗肝脏疾病的药物，所述药物包括口腔来源间充质干细胞外泌体和药学上可接受的载体。

3、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

4、需要说明的是，干细胞及干细胞衍生物治疗是目前的新兴疗法，其可通过归巢和趋化作用靶向损伤位置进行治疗，现有的治疗方法包括间充质干细胞单细胞悬液注射治疗及干细胞外泌体治疗。

5、但间充质干细胞悬液注射后多数细胞易被肺截留，且注射后细胞活性易丧失。同时，有越来越多的证据表明，间充质干细胞主要是通过其旁分泌作用，在组织修复及再生过程中来实现抗炎、促进细胞增殖等效果。因此，主要发挥作用的是间充质干细胞衍生的外泌体，且相较于间充质干细胞，其衍生的外泌体具有免疫原性低可异体使用，小巧灵活，稳定，方便运输和储存等特优点。

6、进一步的，申请人在研究中发现，口腔来源间充质干细胞外泌体相较于其他来源的间充质干细胞外泌体，具有天然高度表达的mirna组合。口腔来源间充质干细胞外泌体相对于其他来源的间充质干细胞外泌体在药物性急性肝损伤和85％大范围肝切除术后导致的肝衰竭具有更为明显的治疗和改善优势。同时，口腔间充质干细胞外泌体还具有来源易得且无创的优势，其比胚胎干细胞和诱导多能干细胞所受伦理争议也较少。

7、根据本发明的一个方面，本技术提出了一种口腔来源间充质干细胞外泌体在制备预防和治疗肝脏疾病药物中的应用。

8、本发明提供的口腔来源间充质干细胞外泌体可广泛应用于预防和治疗肝脏疾病药物的制备过程中。经申请人研究发现，口腔来源间充质干细胞外泌体具有天然高度表达的mirna组合，其相对于其他来源的间充质干细胞外泌体在药物性急性肝损伤和85％大范围肝切除术后导致的肝衰竭的防治过程中，具有更为明显的治疗和改善效果。

9、同时还需要说明的是，本技术将口腔来源间充质干细胞外泌体应用于预防和治疗肝脏疾病药物的制备过程中，相对于现有肝脏疾病药物还具有如下优势：

10、一、本技术口腔来源间充质干细胞外泌体相较于针对肝损伤的传统开创型手术，间充质干细胞外泌体输注具有微创、无痛的优势，以及早预防早治疗的作用；

11、二、本技术口腔来源间充质干细胞外泌体相较于干细胞也具有诸多优势，例如：纳米级生物结构，可通过生物屏障，无血管栓塞风险；免疫原性低；无成瘤及促瘤风险；具有工程化改造的潜能；半衰期较长，便于大量生产、储存及运输。同时，口腔来源间充质干细胞外泌体获取也更为容易，比胚胎干细胞和诱导多能干细胞所受伦理争议也较少。

12、三、间充质干细胞外泌体得益于其本身的结构特点与生物相容性，可做成外泌体制剂便于以后的临床转化。而且本技术口腔间充质干细胞外泌体，得益于其母细胞的天然优势，富含多种有益于再生修复的mirna，并表现出比传统脐带间充质干细胞外泌体更具潜力的治疗优势。

13、在本发明的一种优选实施方式中，所述口腔来源间充质干细胞外泌体由口腔来源间充质干细胞经培养后提取得到；

14、需要说明的是，本发明对于由口腔来源间充质干细胞培养提取外泌体的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员所熟知的实验方法即可；如差速超速离心法、尺寸排阻色谱法、超滤法、切向流等方式方法均可。

15、所述口腔来源间充质干细胞包括：脱落乳牙牙髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞、牙囊前体细胞和根尖牙乳头间充质干细胞，优选为脱落乳牙牙髓间充质干细胞。

16、作为一种优选的实施方式，申请人研究发现，口腔来源间充质干细胞包括：脱落乳牙牙髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞、牙囊前体细胞和根尖牙乳头间充质干细胞，相对于其他来源的间充质干细胞外泌体，均具有天然高度表达的mirna组合。考虑到获取的难易程度，本技术优先选择脱落乳牙牙髓间充质干细胞制备口腔来源间充质干细胞外泌体。

17、在本发明的一种优选实施方式中，所述口腔来源间充质干细胞外泌体的粒径为40～150nm，优选为120～130nm。

18、作为一种优选的实施方式，上述口腔来源间充质干细胞外泌体通过对间充质干细胞的培养后提取得到，相对于通过诱导间充质干细胞凋亡产生的囊泡存在明显的区别。细胞外囊泡，主要分为凋亡小体、微囊泡、外泌体。其分类主要由粒径大小及内含物不同而做出区分。

19、其中：外泌体指直径为40-150nm的微小囊泡。其形成是由早期内体内陷形成多囊体，多囊体再与细胞膜融合后，向细胞外释放而产生的，承担胞间通讯等功能。近些年研究发现，间充质干细胞治疗主要通过旁分泌起作用，而外泌体在旁分泌机制中起主要的生物学作用。凋亡小体指直径为1000-5000nm的小细胞囊泡，是细胞在凋亡过程中，细胞萎缩碎裂形成的由膜包裹的含有胞质和细胞器的小泡。凋亡小体是细胞凋亡过程末期出现的含胞质、细胞器及核碎片的小体。

20、因此，由于诱导间充质干细胞凋亡产生的囊泡与本技术间充质干细胞培养后提取得到的外泌体在内容物上的不同，在细胞治疗过程中，其难以起到与本技术外泌体相应的治疗效果。

21、在本发明的一种优选实施方式中，所述预防和治疗肝脏疾病体现在：口腔来源间充质干细胞外泌体具有天然高度表达的mirna组合。

22、在上述优选实施方式中，所述天然高度表达的mirna组合包括：

23、hsa-let-7b-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-122b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-mir-10b-5p、hsa-mir-139-5p、hsa-mir-451a、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-27a-5p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-27b-3p、hsa-mir-9-5p、hsa-mir-200b-3p、hsa-mir-30d-5p、hsa-mir-143-3p、hsa-mir-183-5p、hsa-mir-200a-3p、hsa-mir-363-3p、hsa-mir-145-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-mir-99a-5p、hsa-mir-361-3p、hsa-mir-574-5p、hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-375-3p、hsa-mir-1307-3p、hsa-mir-493-5p、hsa-mir-493-3p、hsa-mir-3184-3p、hsa-mir-423-5p、hsa-mir-486-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-27a-3p。

24、在本发明的一种优选实施方式中，所述预防和治疗肝脏疾病的药物用于肝损伤；

25、所述肝损伤包括药物性急性肝损伤，优选为硫代乙酰胺诱导的急性肝细胞损伤，和/或四氯化碳诱导的急性肝损伤。

26、需要说明的是，本技术利用硫代乙酰胺(taa)和四氯化碳(ccl4)制备了两种不同的药物性急性肝损伤模型。硫代乙酰胺(taa)是一种肝毒性物质，促使肝细胞发生氧化应激和脂质过氧化反应，应用其复制肝衰竭动物模型，具有肝实质细胞受损和肝功能衰竭的典型特征；四氯化碳(ccl4)具有亲肝的生物学特性，其肝毒性主要通过产生高度反应性的自由基，引起氧化应激和直接的细胞损伤。通过ccl4诱导急性肝损伤炎症反应在机制和症状上接近人类急性药物性肝损伤，模拟临床发生的药物性肝损伤及阐释人类ali的发病机制。

27、在本发明的一种优选实施方式中，所述预防和治疗肝脏疾病药物用于85％大范围肝切除术后导致的肝衰竭。

28、需要说明的是，本技术通过85％大范围肝切除手术建立小鼠急性肝衰竭(alf)模型，是一种与人急性肝衰竭病理过程、生化改变相似，重复性好的动物模型，可用于研究术后肝衰竭发生的病理生理机制、药物筛选及疗效评价。

29、在本发明的一种优选实施方式中，所述预防和治疗肝脏疾病药物的剂型包括：针剂、注射剂、冻干剂中的任意一种。

30、根据本发明的一个方面，一种预防和治疗肝脏疾病的药物，所述药物包括口腔来源间充质干细胞外泌体，所述外泌体由口腔来源间充质干细胞经培养后提取得到，粒径为40～150nm；

31、所述药物还包括药学上可接受的载体。

32、本发明提供的一种预防和治疗肝脏疾病的药物，所述药物包括口腔来源间充质干细胞外泌体和药学上可接受的载体。上述药物由于口腔来源间充质干细胞外泌体具有天然高度表达的mirna组合，相对于其他干细胞外泌体药物对肝脏疾病具有更为明显的治疗和改善效果。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

34、本发明提供的口腔来源间充质干细胞外泌体可广泛应用于预防和治疗肝脏疾病药物的制备过程中。经申请人研究发现，口腔来源间充质干细胞外泌体具有天然高度表达的mirna组合，口腔来源间充质干细胞外泌体相对于其他来源的间充质干细胞外泌体在药物性急性肝损伤和85％大范围肝切除术后导致的肝衰竭的防治过程中，具有更为明显的治疗和改善效果。

35、本发明提供的一种预防和治疗肝脏疾病的药物，所述药物包括口腔来源间充质干细胞外泌体和药学上可接受的载体。上述药物由于口腔来源间充质干细胞外泌体具有天然高度表达的mirna组合，相对于其他干细胞外泌体药物对肝脏疾病具有更为明显的治疗和改善效果。