一种可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物

本发明属于纳米药物，具体涉及一种可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、血脑屏障可阻止血液中的大量物质入脑，选择性让营养物质和代谢产物顺利通过而将各种药物和有毒物质隔离在血脑屏障外，以维持脑组织内环境的相对稳定。因此将治疗性药物递送到脑实质是一个难以完全实现的目标，因为血脑屏障的存在导致98％药物难以到达脑实质发挥作用，仅有不足2％的药物能够通过被动扩散的方式到达脑组织。

3、众多疾病是由于基因突变导致的蛋白质结构和功能异常，小分子靶向药物只能针对不到20％的病变位点。核酸类药物作为基因治疗的一种方式，使更多的病变可以被其在上游靶点所解决，因此核酸药物作为治疗这些疾病的有效方法，具有很大的应用潜力。虽然有较好的治疗效果，但因其难以经过常规给药途径穿过血脑屏障进入大脑而限制了其临床应用。因此，应用核酸药物治疗颅内疾病的前提是提高药物穿过血脑屏障的效率。

4、对核酸药物分子结构的改造很难兼顾生物活性和血脑屏障穿透性，而且鞘内注射药物似乎也较难被患者接受。因此，借助于纳米载体的核酸隐蔽策略似乎是实现颅内疾病治疗目前最有希望的方法。但目前临床应用的纳米药物都是以无机纳米载体为基础，通过被动转运的方式进入无屏障保护的病变组织，而这类纳米药物较难穿过血脑屏障，因为在转运之前往往率先被免疫系统清除。此外，由于肿瘤的异质性，单一的治疗方式难以有效抑制肿瘤生长。

技术实现思路

1、综合以上技术问题，虽然免疫治疗及光动力治疗等为颅内肿瘤的治疗提供了新方向，但单一治疗方式难以有效抑制肿瘤生长。此外目前治疗颅内包括肿瘤等疾病的一个重要障碍是血脑屏障的存在使得药物难以在保持有效性和稳定性的基础上以足够的浓度到达脑内病灶处发挥生物学作用。为解决上述技术问题，本发明提拱了一种可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物，可以有效穿过血脑屏障，抑制肿瘤生长，防止术后肿瘤复发。这种策略为包括gbm在内的无法手术治疗的患者或术后有大量残余肿瘤的患者提供了可选择药物治疗策略。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供了一种可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物，由纳米车以及纳米车内部搭载的光敏剂irps和si-ogg1组成；所述纳米车由表达apoe蛋白并修饰p选择素蛋白的细胞膜组装而形成；所述光敏剂irps的化学式如式(i)所示；

4、

5、优选地，所述细胞膜为使用核苷酸序列如seq id no.1所示的apoe慢病毒质粒转染的细胞的细胞膜。

6、进一步优选地，所述细胞为巨噬细胞。

7、优选地，所述si-ogg1的核苷酸序列如seq id no..2或seq idno.3所示。

8、第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

9、将si-ogg1、光敏剂irps和dlin-mc3-dma溶解于柠檬酸钠缓冲液中，静置后加入纳米车的乙醇溶液，混合物经透析去除杂质后获得所述线粒体靶向免疫刺激纳米药物。

10、优选地，所述si-ogg1的浓度为0.5-0.7mg/ml，所述光敏剂irps的浓度为90-110μm，所述dlin-mc3-dma的浓度为5-7mg/ml，所述纳米车的浓度为5-7mg/ml，所述柠檬酸钠缓冲液与所述乙醇溶液的体积比为1:(2.5-3.5)。

11、优选地，还包括纳米车的制备方法：

12、s1、将绿色荧光蛋白基因、法尼基信号肽基因与apoe基因结合得到核苷酸序列如seq id no.1所示的apoe慢病毒质粒，apoe慢病毒质粒转染细胞获得apoe+细胞；

13、s2、将apoe+细胞用佛波酯预处理后，用促血小板生成素和亚硝基谷胱甘肽诱导成熟使其表达p选择素；

14、s3、收集诱导成熟后的细胞并在ack裂解缓冲液中重悬裂解，裂解终止后离心收集细胞沉淀物，将细胞沉淀物重悬于pbs缓冲液中，超声破坏细胞，离心收集上清液；

15、s4、步骤s3收集的上清液离心，收集膜沉淀，膜沉淀使用pbs重悬后振荡，通过脂质体挤出机反复挤压获得纳米车。

16、优选地，还包括光敏剂irps的制备方法：

17、

18、步骤a、将1,10-菲罗啉-5,6-二酮、对甲醇基苯甲醛及氯化铵的混合物在乙酸溶液中回流，过滤纯化后冻干得到中间体s1；

19、步骤b、将中间体s1与中间体s2溶于二氯甲烷/甲醇混合溶液中加热回流，加热回流后溶液冷却至室温，加入nh4pf6并搅拌，混合物过滤，减压蒸发，所得固体溶解于二氯甲烷，用二氯甲烷/丙酮凝胶洗脱柱层析纯化，获得光敏剂irps。

20、进一步优选地，步骤a中，1,10-菲罗啉-5,6-二酮、对甲醇基苯甲醛及氯化铵的摩尔比为1:(1-1.5):(20-30)，回流温度为90℃，回流时间为2-3h。

21、进一步优选地，步骤b中，中间体s1与中间体s2的摩尔比为2:1，二氯甲烷/甲醇混合溶液中的二氯甲烷和甲醇的体积比为(1.9-2.1):1，nh4pf6加入量为二氯甲烷/甲醇混合溶液体积的5.9-6.1倍。

22、第三方面，本发明提供了如第一方面所述的可以穿过血脑屏障的线粒体靶向免疫刺激纳米药物在制备治疗颅内肿瘤药物中的应用。

23、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

24、(1)立足机制新颖：apoe是脂蛋白颗粒的主要蛋白质成分，长期以来用于脂代谢等方面的研究，本发明基于脂蛋白血脑屏障的运输过程，创造性地提出了通过apoe来构建穿过血脑屏障功能的纳米车。此外本发明药物的治疗机制立足于光动力疗法，作为一种具有非侵入性、副作用小等优点的新兴肿瘤治疗方式，主要是指代谢活跃的肿瘤细胞优先吸收光敏剂后，应用适当的光源照射刺激靶细胞让其产生单线态氧及活性氧簇，直接杀伤肿瘤细胞，从而激活靶细胞的抗肿瘤免疫应答来诱导细胞凋亡。

25、(2)“双靶向”效果好：本发明利用了p-选择素修饰纳米车，实现肿瘤细胞的靶向作用。在此基础上，将含有线粒体靶向光敏剂irps纳米微粒的内部以实现线粒体的精准靶向。

26、(3)抗肿瘤作用显著：利用光敏剂及小干扰rna协同作用提高光动力疗效。将新研发线粒体靶向性光敏剂irps与关键的线粒体dna氧化损伤修复基因的小干扰rna结合到一起，极大提高了线粒体损伤及光动力疗法的肿瘤杀伤效率，弥补了单一光敏剂疗效差的缺点。

27、(4)纳米车生物安全性、相容性高，靶向性好：纳米车直接继承人细胞膜的表面蛋白、抗原，以及天然理化性质，这赋予其天然细胞膜的免疫逃逸、长循环时间和疾病靶向等生物学功能，本发明的纳米车相较其他无机颗粒、合成有机载体具有不可替代的安全性和靶向性。

28、(5)实现核酸药物的靶向递送：核酸药物逐渐被认为是脑内疾病治疗的最终方案，而将核酸药物递送到脑内病灶处并发挥作用是长期难解决的问题，本发明纳米车可以完好地将核酸药物载入其中，穿过血脑屏障到达病灶，同时进入靶细胞中发挥生物学作用，为核酸药物在脑内的应用提供了一个良好的递送载体。

29、(6)应用范围广：本发明纳米车为脑内药物递送提供了一个通用的药物载体，可以较为简便地将各种药物，包括各种核酸药物载入其中；同时对细胞膜工程化改造的多样性又可以针对不同的脑内疾病实现靶向功能。