一种调节卡介苗诱导训练免疫的方法与流程

本发明属于免疫治疗，具体涉及一种调节卡介苗诱导训练免疫的方法。

背景技术：

1、训练免疫(trained immunity)是近几年提出的免疫学新概念，其在一定程度上打破了固有免疫和适应性免疫之间的壁垒。该概念认为，过去认为无记忆能力的固有免疫细胞，在受到刺激后，能够训练产生非特异性的免疫记忆，从而提高了机体抗病原体感染的广谱保护能力。已有多项研究证实了训练免疫的存在，其机制也得到一定程度的阐明。

2、经典的免疫系统可分为固有免疫和适应性免疫两大类别。前者是机体对抗病原体感染的第一道防线，具有应答快速和范围广谱等特征，但免疫应答往往不够强烈且持续时间不长；后者可诱导特异性免疫记忆从而形成长效免疫保护，但免疫反应的诱导需要较长时间。2011年，荷兰传染病学者mihai g.netea博士提出了训练免疫(trained immunity，ti)的概念，也被称作为训练固有免疫(trained innate immunity)或固有免疫记忆(innate immune memory)(netea mg,quintin j,van der meer jw.trained immunity:amemory for innate host defense.cell host microbe.2011,9(5):355-361.)。该观点认为，机体受到某种刺激或感染时，固有免疫细胞受到“训练”，当再次遇到同源甚至异源感染时，其非特异性应答的强度会有所增强，从而更有效地清除感染。目前的研究认为，训练免疫主要受到表观遗传和免疫代谢信号通路调控。

3、卡介苗(bacillus calmette-guérin，bcg)是一种牛型分枝杆菌，能够诱导强烈的训练免疫效应。研究发现，bcg感染会通过nod2受体诱导单核细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞akt-mtor-hif1α通路介导的有氧糖酵解能力增强，或改变三羧酸循环(tricarboxylicacid cycle，tca)的不同代谢产物的分泌水平，来调控训练免疫的诱导能力(kleinnijenhuis j,quintin j,preijers f,joosten la,ifrim dc,saeed s,etal.bacille calmette-guerin induces nod2-dependent nonspecific protection fromreinfection via epigenetic reprogramming of monocytes.proc natl acad sci u sa.2012,109(43):17537-17542.)。实际上，在训练免疫的概念被提出前，其实已存在很多证据证明bcg是具有非特异保护能力的。二十世纪末进行的多项临床研究均发现，在去除了经济和生活水平等混杂因素之后，卡介苗和麻疹等疫苗的免疫，能够在整体上降低儿童的死亡率。后续的研究提示，卡介苗诱导的死亡率降低是因为它可以降低儿童/青少年呼吸系统疾病和脓毒血症的发生率(biering- s,aaby p,lund n,monteiro i,jensen kj,eriksen hb,et al.early bcg-denmark and neonatal mortality among infantsweighing<2500g:a randomized controlled trial.clin infect dis.2017,65(7):1183-1190；garly ml,martins cl,baléc,baldéma,hedegaard kl,gustafson p,et al.bcgscar and positive tuberculin reaction associated with reduced child mortalityin west africa.a non-specific beneficial effect of bcg？vaccine.2003,21(21-22):2782-2790；glynn jr,dube a,fielding k,crampin ac,kanjala c,fine pem.theeffect of bcg revaccination on all-cause mortality beyond infancy:30-yearfollow-up of a population-based,double-blind,randomised placebo-controlledtrial in malawi.lancet infect dis.2021.)。另外，bcg膀胱内灌注已经是非肌层浸润性膀胱癌的常规治疗手段，但其机制尚未被阐明。近年来的研究发现，该效应与bcg诱导的训练免疫相关(van puffelen jh,keating st,oosterwijk e,van der heijden ag,neteamg,joosten lab,et al.trained immunity as a molecular mechanism for bcgimmunotherapy in bladder cancer.nat rev urol.2020,17(9):513-525.)。因此，进一步提高bcg诱导的训练免疫以及非特异保护效力，对于增强其应用价值有重要意义。

4、早在1921年，人类首次使用bcg预防结核病之后，bcg原始菌株通过各种途径被运送至不同的国家和地区(abdallah am,behr ma.evolution and strain variation inbcg.adv exp med biol.2017,1019:155-169.)。在不同的培养体系中，bcg经历了多次变异，最终形成不同的毒株。其中，使用范围较广的是巴斯德株(bcg-pasteur)、俄罗斯株(bcg-russia)、瑞典株(bcg-sweden)和中国株(bcg-china)等。流行病学研究显示，bcg在不同的国家/地区对结核病和其他疾病的免疫保护效率差异很大(zhang l,ru hw,chen fz,jin cy,sun rf,fan xy,et al.variable virulence and efficacy of bcg vaccinestrains in mice and correlation with genome polymorphisms.mol ther.2016,24(2):398-405；mangtani p,abubakar i,ariti c,beynon r,pimpin l,fine pe,etal.protection by bcg vaccine against tuberculosis:a systematic review ofrandomized controlled trials.clin infect dis.2014,58(4):470-480；schaltz-buchholzer f,bjerregaard-andersen m,golding c,stjernholm eb,monteiro i,etal.early vaccination withbacille calmette-guérin-denmark or bcg-japan versusbcg-russia to healthy newborns in guinea-bissau:a randomized controlledtrial.clin infect dis.2020,71(8):1883-1893.)，该效应是否与训练免疫的诱导相关尚不清楚。目前，尚未有研究系统比较过不同bcg菌株诱导训练免疫能力的差异以及内在调控机制。

技术实现思路

1、为解决现有技术问题，本发明以更新的思路解析bcg诱导训练免疫的机制。首先在细胞实验和啮齿类动物模型中发现不同bcg诱导训练免疫的差异，并利用多组学分析发现亚油酸参与介导不同bcg菌株诱导不同训练免疫水平的新型机制，通过该机制筛选相关通路的激动剂，找到增强bcg诱导训练免疫能力的新型刺激剂。

2、具体地，本发明首先比对了bcg四种基因型的代表菌株诱导训练免疫表型和非特异保护能力的差异，且发现bcg-china诱导非特性保护的能力比bcg-russia强。然后，通过转录组学和代谢组学，分析和筛选与不同bcg菌株诱导训练免疫能力不同基因的表达和调控水平以及代谢产物的差异。转录发现bcg-china较bcg-russia更加明显地激活巨噬细胞炎症相关的通路，且甘油磷脂代谢、亚油酸代谢的趋势和非特异性保护趋势一致。代谢组学表明bcg训练后巨噬细胞的脂质代谢改变最为明显，特别是甘油磷脂类，而且亚油酸及其代谢物的浓度趋势和非特异性保护趋势一致(bcg-china较bcg-russia强)。代谢组学和转录组学联合分析将不同bcg诱导训练免疫的能力差异的机制锁定在甘油磷脂-亚油酸代谢通路上。最后，通过相关性分析进一步确认了亚油酸代谢和细胞炎症反应成正相关，并选择亚油酸和甘油磷脂-亚油酸通路的关键酶pla2酶的激动剂(毒蜂肽：melittin)和抑制剂(ono:ono-rs-082；naa:1-naphthylacetic acid)验证了亚油酸和炎症反应的关系。直接补充亚油酸以及激活亚油酸产生都可以诱导训练免疫，也可以增强bcg诱导的训练免疫。在此基础上，本发明提供了一种调节卡介苗诱导训练免疫的方法，以及一种卡介苗佐剂、一种抗感染/抗肿瘤免疫治疗制剂和一种抗炎制剂。

3、本发明的具体技术方案如下：

4、本发明提供了一种调节卡介苗诱导训练免疫的方法，其特征在于，该方法通过调节亚油酸代谢通路实现卡介苗诱导训练免疫的调节，包括：增强亚油酸代谢通路以增强卡介苗诱导训练免疫并预防感染和治疗肿瘤；或抑制亚油酸代谢通路以抑制卡介苗诱导训练免疫并抑制炎症反应。

5、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，训练免疫为固有免疫细胞和/或非传统免疫细胞再次应对刺激的增强反应；亚油酸代谢为亚油酸合成和下游代谢；固有免疫细胞选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和粒细胞，非传统免疫细胞选自内皮细胞和表皮细胞；下游代谢为脂肪酸分解和/或脂肪酸氧化。

6、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，增强亚油酸代谢通路的方法为直接添加亚油酸和/或使用能增加亚油酸产生的激动剂，能增加亚油酸产生的激动剂为磷脂酶a2激动剂，磷脂酶a2激动剂为毒蜂肽。

7、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，增强卡介苗诱导训练免疫的过程中，增强亚油酸代谢通路使用的亚油酸和/或能增加亚油酸产生的激动剂在卡介苗接种前使用，或和卡介苗以相同途径或不同途径接种一起使用；预防感染和治疗肿瘤的过程中，增强亚油酸代谢通路使用的亚油酸和/或能增加亚油酸产生的激动剂采用腹腔注射、静脉注射或瘤内注射；肿瘤为lewis肺癌。

8、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，抑制亚油酸代谢通路的方法为使用能抑制亚油酸产生的抑制剂，能抑制亚油酸产生的抑制剂为磷脂酶a2抑制剂，磷脂酶a2抑制剂选自ono-rs-082和1-naphthylacetic acid。

9、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，抑制炎症反应是指减少炎性细胞因子的分泌，炎性细胞因子为tnf-α、il-6和il-1β。

10、本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法，还具有这样的技术特征，其中，通过调节亚油酸代谢通路实现卡介苗诱导训练免疫的调节的方式为直接体内注射亚油酸和能增加亚油酸产生的激动剂中的一种或两种或能抑制亚油酸产生的抑制剂进入血液循环以刺激免疫细胞；或将免疫细胞分选出来在体外采用亚油酸和能增加亚油酸产生的激动剂中的一种或两种或能抑制亚油酸产生的抑制剂刺激免疫细胞后回输体内。

11、本发明还提供了一种能用于上述调节卡介苗诱导训练免疫的方法的卡介苗佐剂，其特征在于，该卡介苗佐剂含有亚油酸和能增加亚油酸产生的激动剂中的一种或两种；或该卡介苗佐剂含有能抑制亚油酸产生的抑制剂。

12、本发明还提供了一种能用于上述方法中所述预防感染和治疗肿瘤的抗感染/抗肿瘤免疫治疗制剂，其特征在于，该抗感染/抗肿瘤免疫治疗制剂含有亚油酸和能增加亚油酸产生的激动剂中的一种或两种。

13、本发明还提供了一种能用于上述方法中所述抑制炎症反应的抗炎制剂，其特征在于，该抗炎制剂含有能抑制亚油酸产生的抑制剂。

14、发明的作用与效果

15、由于卡介苗在包括中国在内的大多数国家都是计划免疫接种的重要组成部分。卡介苗在婴儿时期的免疫，不仅提高接种者抵抗结核菌感染的能力，而且能够通过广谱抗感染免疫力的提高，在整体上降低儿童夭折率；另外，卡介苗灌注是非肌层浸润性膀胱癌的常规治疗手段之一，其免疫治疗有效提高了膀胱癌患者的生存时间。

16、因此，本发明解析了不同卡介苗菌株诱导训练免疫能力的差异以及相关的分子通路，获得调节卡介苗诱导训练免疫的方法，该方法通过调节亚油酸代谢通路实现卡介苗诱导训练免疫的调节。本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法对于增强卡介苗诱导训练免疫临床应用的可能性具有重要意义：一方面，可以利用增强训练免疫来提高bcg诱导的广谱抗感染/抗肿瘤的免疫治疗效力；另一方面，可以利用训练免疫刺激剂作为疫苗佐剂，提高非特异性保护并增强其抗原特异性免疫保护的诱导能力。本发明提供的调节卡介苗诱导训练免疫的方法在提高卡介苗诱导的非特异性保护方面具有重要意义。