壳寡糖辅助的核酸与小分子药物共载技术

本发明属于医药领域，具体涉及一种壳寡糖辅助的核酸与小分子药物共载技术，及使用该技术制备的脂质纳米颗粒对抗黑色素瘤中的用途。

背景技术：

1、1、黑色素瘤简介

2、恶性黑色素瘤是具有极高死亡率的恶性肿瘤之一，具有发病隐秘，易产生耐药性，治疗反应差的特点，死亡病例占皮肤肿瘤死亡病例的80％。黑色素瘤在临床组织学类型分为恶性雀斑痣样黑色素瘤、浅表播散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤和肢端雀斑痣样黑色素瘤四种。由于好发于手掌、手指、足跟和黏膜等处，发病部位隐秘、恶性程度较高，具有极高的死亡率。

3、临床治疗主要采用化学药物来消灭肿瘤细胞，然而这种治疗方式可能导致肿瘤对药物产生耐药性。其中一个耐药性因素是生存素蛋白的高表达，作为细胞凋亡家族抑制蛋白，生存素蛋白在多种肿瘤组织或癌症化疗晚期组织中呈上调状态，而在正常组织中却很少检测到。这表明生存素蛋白可能在促使肿瘤增殖和对化疗药物产生耐药性方面发挥作用。通过生存素蛋白的敲除或药理抑制，有望克服化学药物耐药性的问题。

4、2、纳米药物简介

5、纳米药物是纳米技术、药学和生物医学科学的融合，并随着新型纳米制剂的出现而迅速发展。美国食品药品监督管理局(fda)对纳米制剂的定义是1-100纳米(nm)范围内的纳米颗粒组合的制剂；或尺寸在此范围之外却显示出与尺寸相关特性的制剂型式。

6、小分子化疗药物是临床中在肿瘤治疗中采用的最广泛的治疗方法。尽管人们已经发现或合成了许多化疗药物，但小分子化疗药物存在局限性，小分子药物缺乏靶向性导致在肿瘤部位的低积累。纳米颗粒可有效解决靶向性问题，与游离小分子药物相比，纳米颗粒具有许多优势：靶向修饰的脂质纳米颗粒可以增加药物在靶器官的积累以及在肿瘤部位的渗透，增加药物溶解度、提高药代动力学，减少药物在非靶向部位的释放。

7、3、核酸类药物介绍

8、核酸是所有生命体遗传信息的载体，利用核酸分子的翻译和调控功能，作为干预疾病的药物，即为核酸药物。核酸药物主要分为小核酸药物和信使核糖核酸(mrna)两大类，小核酸药物包括反义核苷酸(aos)、小干扰核酸(sirna)、微小核酸(mirna)、核酸适配体及其他。其中，小干扰核酸由于易合成生产成本低而得到广泛的关注。小干扰核酸的药物治疗机制是基于核糖核酸干扰机理，这个现象是降解转录后的信使核糖核酸以达到基因沉默效果。小干扰核酸是人为合成的长度为15至20个核苷酸之间的双链核糖核酸分子，进入细胞质中形成沉默复合体的前体(pre-risc)。随后pre-risc中的小干扰核酸正链被降解，负链被保留形成成熟的沉默复合体(risc)，沉默复核体会与靶向的信使核糖核酸序列结合，切割信使核糖核酸导致基因表达沉默。

9、与常规药物相比，核酸药物由于其基因沉默的高效性为癌症提供了可能的治疗途径。然而，由于核酸自身携带大量的负电荷、高分子质量的大尺寸和亲水性等原因，导致其难以有效的透过细胞膜发挥其功效，并且核酸在体内稳定性较低，容易被细胞外核酸酶降解。所以保护和促进核酸进入到靶细胞并有效转染的纳米颗粒递运系统对发挥核酸药物的治疗作用至关重要。

技术实现思路

1、本发明第一方面提供了一种多糖辅助装载核酸-小分子药物共载纳米颗粒，包括带正电荷富含正电荷的多糖与带负电荷的核酸分子相互静电吸引作为核材料，添加小分子药物的脂质材料作为壳材料。该类纳米颗粒利用电荷相互吸引的原理将核材料与壳材料静电吸引，大大提高对核酸类物质的包封率。所述富含正电荷的多糖优选为壳寡糖(cos)，进一步优选为分子量为680至3400da的壳寡糖；所述核酸分子为小干扰rna(sirna)，进一步优选为能有效降低生存素蛋白的小干扰rna；所述纳米颗粒中，壳寡糖与核酸的使用比例在1:1至200:1(w:w)之间，优选为100:1。所述小分子药物为脂溶性化疗药物，进一步优选为抑制肿瘤细胞增殖的化合物紫杉醇(ptx)；所述小分子药物的用量比为1/20至1/10(w/w)之间，优选1/10(w/w)。脂质材料选自磷脂化合物、磷脂聚合物、胆固醇中的一种或多种，其中磷脂化合物选自pc、pe、ps、pops、dppc、dppe、dspe等，磷脂聚合物选自dspe-peg等。

2、本发明第二方面提供了一种多糖辅助装载核酸-小分子药物共载纳米颗粒的制备方法，采用带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖壳寡糖，利用电荷相互吸引的原理使其与带负电荷的核酸分子相互静电吸引，两者结合后便于被添加小分子药物的脂质材料包裹，使用该方法可极大提高纳米颗粒对核酸类物质的包封率。具体的，本发明纳米颗粒制备方法可采用薄膜分散法，将pops、dspe-peg、胆固醇等脂质材料和ptx等小分子药物材料溶解在有机溶剂中，在室温下通过旋转蒸发仪除去有机溶剂得到均匀的薄膜；将一定比例的壳寡糖和sirna溶解在pbs中并充分分散，将该溶液加入到上一步制备的装有薄膜的瓶中，超声处理一定时间后，通过脂质体挤出仪挤出得到纳米颗粒混悬液。

3、实施例2和图1核酸电泳结果显示，纳米颗粒中壳寡糖与sirna的比例对sirna包封率起关键作用，优先的壳寡糖与sirna为100比1时核酸光斑最集中，表明纳米颗粒对sirna包封率最高。实施例3-2和图2纳米颗粒粒径分析结果显示，该方法制备的纳米颗粒平均粒径约为100纳米，且粒径分布集中。实施例9和图8壳寡糖对b16细胞的细胞毒性实验结果显示，10-1500μg/ml壳寡糖对b16细胞没有影响，表明壳寡糖生物相容性较好，可作为纳米颗粒载体组分。实施例11和图10靶向修饰的空载脂质纳米颗粒对b16细胞的细胞毒性实验结果，0.5-1000μg/ml的靶向修饰的空载脂质纳米颗粒对b16细胞活性无影响，生物相容性较好，作为药物载体不会对机体造成损伤。

4、本发明第三方面是提供了一种对肿瘤细胞具有靶向性的装载核酸-小分子药物共载纳米颗粒，包括以富含正电荷的多糖和带负电荷的核酸分子相互静电吸引作为核材料，添加小分子药物的脂质材料和肿瘤靶向性的天然脂溶性组分作为壳材料。所述天然脂溶性组分为皂苷提取物，进一步优选为人参皂苷(rg3型)；所述天然脂溶性组分的用量比为1/10至5/10(w/w)之间，优选3/10(w/w)。该类纳米颗粒中的人参皂苷(rg3)含有两个葡萄糖残基，作为纳米颗粒的外层组分可使纳米颗粒表面暴露葡萄糖残基，从而与肿瘤细胞膜表面的葡萄糖受体结合，实现纳米颗粒对肿瘤细胞的高效靶向性。

5、本发明第四方面提供了一种靶向修饰装载核酸-小分子药物共载纳米颗粒的制备方法。具体的，在纳米颗粒制备过程中，将充分溶解后的人参皂苷(rg3)加入配置好的添加小分子药物的脂质材料溶剂中，充分混合后，在室温下通过旋转蒸发仪除去有机溶剂得到均匀的薄膜；将一定比例的壳寡糖和sirna溶解在pbs中并充分分散，将该溶液加入到上一步制备的装有薄膜的瓶中，超声处理一定时间后，通过脂质体挤出仪挤出得到纳米颗粒混悬液。

6、本发明第五方面提供了靶向修饰的核酸与小分子药物共载脂质纳米颗粒的用途，尤其是抗肿瘤效果。

7、为检测纳米颗粒的靶向性，在实施例14中制备了装载脂溶性染料dio纳米颗粒，在实施例15中制备装载水溶性染料flu纳米颗粒，分别用于检测该纳米颗粒在rg3的靶向作用下将所携带的脂溶性染料和水溶性染料靶向递运至肿瘤部位和肿瘤细胞的能力。实施例14和图13、14结果显示，相比于含胆固醇构成的装载dio的纳米颗粒，b16细胞对含rg3构成的装载dio的纳米颗粒摄取更高；实施例15和图15、16结果显示，相比于含胆固醇构成的装载flu的纳米颗粒，b16细胞对含rg3构成的装载flu的纳米颗粒摄取更高。实施例16和图17、18结果显示，在动物体内rg3构成的纳米颗粒在肿瘤部位积蓄最高。以上实验结果表明，含rg3组分的纳米颗粒装载脂溶性物质和水溶性物质，都可实现对肿瘤的靶向性。

8、根据实施例12细胞活性实验和图11显示，整体浓度为仅25μg/ml的靶向修饰的核酸与小分子药物共载脂质纳米颗粒就会对b16细胞造成显著性损伤。由实施例5pcr实验和图3可知，加入靶向修饰的核酸装载脂质纳米颗粒组的细胞的生存素蛋白的mrna表达明显降低，与空白组相比存在显著性差异，达到了与传统sirna转染试剂lipo2000相同的效果(注：lipos2000仅为转染试剂，用于验证核酸的效果，不能用于体内实验且无药用性)。实施例6细胞周期实验和图4、5、6表明靶向修饰的核酸装载脂质纳米颗粒可延长b16肿瘤细胞的g2期，有效抑制肿瘤增殖。实施例13细胞迁移实验和图12结果显示靶向修饰的核酸与小分子药物共载脂质纳米颗粒细胞培养24小时后，划痕清晰明显，表明装载sirna和ptx的纳米颗粒可有效抑制肿瘤迁移。实施例17动物抗肿瘤实验和图19结果显示，静脉注射靶向修饰的核酸与小分子药物共载脂质纳米颗粒组，肿瘤体积最小，肿瘤明显生长缓慢。表明靶向修饰的sirna与ptx共载脂质纳米颗粒有良好的抗肿瘤药效。

9、相比现有技术，本发明的技术效果如下：本发明针对核酸药物高水溶性导致递运系统装载率不高，使用效果欠佳的问题，提出了采用正电荷多糖静电吸附后高包封率装载的技术，实现了对核酸大分子接近100％的包封。利用该技术，装载了能够有效抑制肿瘤细胞生存素蛋白的sirna，并实现了与化疗药物共载共用。通过在外层脂质体层中添加脂溶性的人参皂苷，实现了对肿瘤的靶向功能，在化疗药物大量杀死肿瘤细胞的同时sirna发挥作用沉默肿瘤细胞的耐药性蛋白，全面增强药物的抗瘤效果。本发明纳米颗粒的性能稳定，毒性小，安全可靠，在整个纳米颗粒的制备过程中，无任何化学反应的参与，能稳定便捷的快速制备，极大程度上减低随后的工业化生产放大的生产工艺难度。

10、本发明中。如无特殊说明，其中：术语“cos”是指壳寡糖。术语“sirna”是指小干扰rna。术语“ptx”是指紫杉醇。术语“rg3”是指人参皂苷rg3亚型。术语“ps”是指磷脂酰丝氨酸。术语“pc”是指磷脂酰胆碱。术语“pe”是指磷脂酰乙醇胺。术语“pops”是1-棕闾酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。术语“dppc”是指二棕榈酰磷脂酰胆碱。术语“mrna”是指信使核糖核酸。术语“aos”是指反义核苷酸。术语“mirna”是指微小rna。术语“dspe-peg”是指二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。术语“b16”是指小鼠黑色素瘤细胞。术语“dio”是指细胞膜绿色荧光探针。术语“flu”是指荧光素钠。术语“pcr”是指聚合酶链式反应，通常用于检测特定基因的表达水平。术语“suvivin”是指生存素蛋白。术语“pbs”是指磷酸盐缓冲溶液。术语“od值”是指通过酶标仪检测得到的吸光度值。术语“min”是指时间分钟。术语“h”是指时间小时。术语“g”是指离心力。术语“rpm”是revolutions per minute的缩写，即转每分，表示设备每min的旋转次数。术语“cck-8”是指一种基于小分子wst-8制作的被普遍应用于快速检测细胞增殖和细胞毒性的高灵敏性的检测试剂。术语“fbs”是指胎牛血清。术语“dmem”全称dulbecco's modified eagle medium，是指一种广泛应用于细胞培养领域的基本培养基。术语“cy7”是指花氰染料cy7。术语“trizon”是指rna提取试剂。