一种包载mRNA脂质纳米粒递送系统的水凝胶的制备及其在肌肉损伤治疗的应用的制作方法

本发明属于生物医药，涉及一种包载mrna脂质纳米粒递送系统的水凝胶的制备及其应用。

背景技术：

1、容积性肌肉损伤(volumetric muscle loss)指的是骨骼肌损失超出肌肉修复能力范围而导致的不可逆性功能受损，如战争、手术和车祸等创伤性损伤。该疾病严重影响患者的生活，目前临床常见的治疗方案如自体肌肉移植、截肢等，均操作复杂且不能完全恢复受损肌肉的功能。

2、近年来，基于细胞治疗、活性因子及支架的组织工程学技术广泛应用于容积性肌肉损伤的治疗研究。多种细胞类型如肌肉干细胞、肌源性祖细胞及诱导的多功能干细胞等被应用于肌肉修复。特定的活性因子如hgf、fgf2、igf-1和wnt7a是骨骼肌再生的关键调控因素，它们参与了肌肉再生过程中的细胞募集、增殖和分化等过程，发挥着促肌肉生成、血管化、神经支配及免疫调控的功能。另外，多种天然或合成材料构成的填充支架如细胞外基质、透明质酸水凝胶体系、聚乳酸-羟基乙酸(plga)3d网状结构，可附着在损伤部位，以弥补缺失的天然细胞外基质，促进细胞附着及组织重塑。

3、pct/us2029/028558公开了一种基于透明质酸的水凝胶体系用于治疗容积性肌肉损伤，该系统由丙烯酸化的透明质酸聚合物、生长因子募集基团(肝素及其衍生物)及酶可清除的肽链接组成。与未治疗组相比，水凝胶处理组显著改善了肌肉损伤程度，主要表现为再生肌肉质量、体积和血管化程度的增加。鉴于肌肉损伤复杂的修复机制，仍需找寻关键的治疗靶点并开发新型治疗策略。

4、巨噬细胞在损伤肌肉修复过程中发挥极其重要的作用。有研究表明巨噬细胞分泌的一种关键信号分子nampt可作用于肌肉干细胞表面的ccr5受体，激活干细胞增殖和分化。将人源重组nampt蛋白移植于小鼠的肌肉损伤部位后，再生面积增加了约2.5倍，再生区域的纤维化程度降低了约4倍，并伴随着良好的血管化程度，在现有的肌肉损伤治疗研究中效果突出，具备良好的应用前景。该重组蛋白虽然显著改善了受损肌肉的再生，但重组蛋白存在生产纯化昂贵复杂、稳定性差、半衰期短，并且可能存在免疫原性等问题。

5、mrna作为一种新兴的核酸药物，其安全有效性已被mrna疫苗验证。体外转录的外源性mrna能够利用宿主自身的翻译工具编码各种功能性蛋白，而且一个mrna分子可以翻译产生多个蛋白质分子。相比dna而言，mrna无需进入细胞核即可发挥作用，无整合进入宿主基因组的风险。

技术实现思路

1、鉴于容积性肌肉损伤治疗的临床现状和需求，本发明提出了一种基于mrna编码目标蛋白nampt的蛋白替代治疗策略，以实现肌肉损伤修复。

2、第一方面，本发明提供一种可编码nampt蛋白的mrna序列，能够利用宿主细胞内的翻译体系翻译出目的蛋白。

3、编码nampt蛋白的mrna(从上海伟寰生物科技有限公司apexbio定制得到)的尿嘧啶为假尿嘧啶(ψ)修饰。其包含帽子结构m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg，5’utr(5’端非翻译区)，编码nampt蛋白的编码区(序列经过人源化密码子优化，见seq id no.1)，3’utr(3’端非翻译区)和多聚腺苷酸尾(120个腺苷酸)。所述mrna编码得到的蛋白序列见seq id no.2。

4、第二方面，本发明提供一种适用于肌肉修复的mrna脂质纳米粒递送系统，该mrna递送系统由编码nampt蛋白的mrna序列及mrna脂质纳米递送载体组成。

5、本发明利用载体将编码nampt蛋白的mrna递送进入肌肉部位细胞，在细胞内翻译产生nampt蛋白。

6、优选地，所述递送载体负载第一方面所述的编码nampt蛋白的mrna。

7、优选地，所述递送载体包括脂质纳米粒。

8、优选地，所述递送载体包括可离子化脂质分子、辅助脂质及聚乙二醇脂质。

9、优选地，所述可离子化脂质分子与辅助脂质分子的摩尔比为(1-5):1，包括但不限于2:1、3:1或4:1。

10、优选地，所述可离子化脂质分子与聚乙二醇脂质分子的摩尔比为(50-150):1，包括但不限于60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1或者140:1。

11、优选地，所述可离子化脂质分子和mrna的氮磷比为(1-5):1，包括但不限于2:1、3:1或4:1。

12、优选地，所述可离子化脂质分子包括n,n'-(1,3-亚苯基双(亚甲基))双(十二烷-1-胺)，结构式如下所示：

13、

14、优选地，所述辅助脂质包括1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、二油酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、胆固醇、3β-[n-(n',n'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、粪固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中的任意一种或至少两种的组合。

15、优选地，所述聚乙二醇脂质选自聚乙二醇改性的磷脂酸、聚乙二醇改性的磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇改性的神经酰胺、聚乙二醇改性的二烷基胺、聚乙二醇改性的二烷基甘油、聚乙二醇改性的二酰基甘油中的任意至少一种。优选为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、二硬脂酰-rac-甘油-聚乙二醇2000、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、聚乙二醇-二酰基甘油酰胺、聚乙二醇-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺。

16、第三方面，本发明提供一种第二方面所述的mrna脂质纳米粒递送系统的制备方法，所述制备方法包括：

17、将所述递送载体与所述编码nampt蛋白的mrna混合孵育，得到所述的适用于肌肉的mrna脂质纳米粒递送系统。

18、优选地，所述递送载体包括可离子化脂质分子、辅助脂质及聚乙二醇脂质的混合液。

19、优选地，所述可离子化脂质分子、辅助脂质及聚乙二醇脂质溶解于有机溶剂中。

20、优选地，所述有机溶剂包括乙醇。

21、优选地，所述mrna溶解于ph为3～8的缓冲液中。

22、优选地，所述缓冲液包括磷酸盐(pbs)缓冲液。

23、第四方面，本发明提供一种包载mrna脂质纳米粒递送系统的水凝胶，该包载mrna脂质纳米粒递送系统的水凝胶包括第二方面所述的mrna脂质纳米粒递送系统及热敏型填充介质，可在4℃呈液态，37℃迅速成胶，可在损伤部位实现局部蛋白表达。

24、优选地，所述热敏型水凝胶材料包括泊罗沙姆407。

25、优选地，泊罗沙姆407溶解于ph为3～8的缓冲液中。

26、优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。

27、优选地，所述包载mrna脂质纳米粒递送系统的水凝胶中泊罗沙姆407的比例为15％-25％(w/w),包括但不限于16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％或24％。

28、第五方面，本发明提供一种第一方面所述的编码nampt蛋白的mrna序列、第二方面所述的mrna脂质纳米粒递送系统或第四方面所述的包载mrna脂质纳米粒递送系统的水凝胶在治疗容积性肌肉损伤中的应用。

29、与现有技术相比，本技术具有的有益效果在于：(1)本发明借助宿主自身的翻译工具，将脂质纳米粒递送系统中编码nampt蛋白的mrna翻译成所需的蛋白分子。这种蛋白替代疗法不仅能够获得nampt蛋白的突出疗效，也具备快捷生产、免疫原性低等特性。(2)本发明所述水凝胶以热敏型材料作为mrna递送系统的填充介质，能够在低温下呈液态而体温条件下原位成胶，便于填充于缺损肌肉部位，实现损伤区域局部表达治疗性nampt蛋白，最终发挥促进损伤肌肉组织重塑的作用。