一种用于组织器官修复的复合生物材料及其制备和应用方法

本发明属于生物材料领域，具体涉及到一种用于组织器官修复的复合生物材料的制备方法。

背景技术：

1、目前，病损组织器官修复主要依靠自体和异体移植，即从自身或异体供体部位移植到缺损部位。但供体组织器官数量有限，异体移植细胞的免疫排斥等问题得不到有效解决。

2、水凝胶(hydrogel)是以水为分散介质的胶体状高分子材料。是一种高分子网络体系，能吸收大量的水分，性质柔软，且能保持一定的形状。具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。

3、原位热敏水凝胶是组织器官修复的可行候选材料，因为其快速和可逆的溶胶-凝胶转变行为取决于温度而无需其他外部刺激，如ph、光或化学、酶交联剂。这种热敏水凝胶可以设计为加载抗菌和生物活性因子的伤口敷料，用于抗菌治疗和加速愈合。泊洛沙姆（poloxamer，polo）是一种两亲型性三嵌段共聚物，由亲水性聚氧乙烯（peo）和疏水性聚氧丙烯（ppo）-聚氧化乙烯（pee）共聚合而成。是一种具有良好生物相容性和药物缓释功能的温敏性水凝胶，具有在体温下的反向热凝胶特性，为创口周围组织再生提供细菌屏障和湿润的愈合条件。然而，单一或两种的polo聚合物，如pluronic f127、f68和f127，形成胶束时普遍存在稳定性差、功能单一等问题，促进组织器官修复的效果较差，限制了在临床中的应用。

4、已知组织器官修复是一个复杂的生物学过程，是炎症细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度调节、相互协调的复杂过程。单独将活细胞和生物活性物质（或活性因子）注射到病损部位，常被宿主体液冲刷掉或被当成异物吞噬掉，起不到促进组织器官修复的目的。固体高分子材料植入体内时需要预先确定病损部位的体积、形状，进行手术切割等，引起伤口感染、炎症反应、免疫排斥等一系列并发症或副反应，达不到理想的治疗效果。

5、本发明提供了一种用于组织器官修复的复合生物材料的制备方法，综合利用活细胞、生物活性物质和温敏性泊洛沙姆（f127/f68/f108）水凝胶的优良特性，构建既可注射、又可涂敷、也可用于模具成形和3d打印的多功能复合生物材料，促进生物型人工组织器官体外制造和体内修复作用。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于组织器官修复的复合生物材料及其制备和应用方法。首次将活细胞、生物活性物质、药物与水凝胶复合，制备可注射、可涂敷、可用于模具成形及三维（3d）打印的多功能复合生物材料。该材料具备良好的生物相容性、体内安全性、抗压抗张能力（弹性模量或机械强度较高）和组织器官生成能力。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

3、本发明提供了一种用于组织器官修复的复合生物材料，其特征在于，所述复合生物材料包括活细胞、生物活性物质、药物和泊洛沙姆（f127/f68/f108）水凝胶。

4、进一步地，所述f127/f68/f108水凝胶中f127、f68与f108的质量百分比比例为50:5:1～6:3:1，其中最优比例为18:5:1。

5、进一步地，所述活细胞包括成体活细胞、干细胞中的一种或两种以上复合物；其形态可以是纳米微球、离心沉淀物、不定形、细胞悬液；其含量在f127/f68/f108水凝胶中的质量百分比为0.1%～10%。

6、进一步地，所述生物活性物质包括细胞因子、生长因子、细胞外泌体、有机高分子、细胞外基质材料（ecm）、脱细胞外基质材料（dat）、无机氧化物、硫化物、无机盐及微量元素中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在f127/f68/f108水凝胶中的质量百分比为0.01%～20%。

7、进一步地，所述药物包括治疗用物和预防性生物制剂--疫苗中的一种或两种以上复合物；其形态可以是粉末状、纳米颗粒、纳米微球或不定形；其含量在f127/f68/f108水凝胶中的质量百分比为0.01%～1%。

8、本发明还提供了一种上述任一所述复合生物材料在制备病损组织器官修复材料中的应用方法，包括糖尿病创面（dws）、肿瘤切除空缺部位填充、粉碎性骨折、软组织修复、压疮、痔疮及美容整形（矫形）中的应用。

9、本发明还提供了一种上述任一所述复合生物材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

10、（1）f127/f68/f108水凝胶制备：将f127、f68、f108粉末分别以一定比例混合后溶于水、pbs溶液或dmem细胞培养液中，4℃下溶胀12h，升温至37℃，搅拌均匀；

11、（2）活细胞悬液制备：收集细胞放入培养瓶中培养，将培养瓶中融合度达80%以上的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化、离心，制得离心沉淀物，将离心沉淀物悬浮于0.5mlpbs溶液或dmem细胞培养液中，制得活细胞悬浮液；

12、（3）生物活性物质微球制备：将明胶粉末溶于pbs溶液，制成质量百分比为10%～30%的明胶溶液；或将明胶、海藻酸钠粉末分别溶于pbs溶液，制成质量百分比为20%、5%的明胶、海藻酸钠溶液，两者以1：1混合，制得明胶/海藻酸钠混合溶液；将细胞、生长因子、细胞外泌体、药物粉末或离心沉淀物等分别或两个以上复合后加入0.5ml pbs溶液或细胞培养液，再以质量百分比为0.01%～20%加入明胶或明胶/海藻酸钠混合液中，搅拌均匀，制得含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠混合物，利用注射器将含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠混合物分别注入京尼平pbs溶液（京尼平浓度为10～100mg/ml）或氯化钙pbs溶液中（氯化钙浓度1%～20%（w/v）），过滤、收集含细胞、生长因子、细胞外泌体及药物的明胶或明胶/海藻酸钠纳米微球；

13、（4）活细胞、生物活性物质、药物与f127/f68/f108水凝胶复合：将活细胞、生物活性物质粉末、药物悬浮液或纳米颗粒中的一种或两种以上复合物以0.01%～20%的质量百分比加入到f127/f68/f108水凝胶中，37℃环境下搅拌均匀，制得含活细胞、生物活性物质及药物的f127/f68/f108复合生物材料。

14、进一步地，（1）中所述f127/f68/f108水凝胶中f127、f68与f108的质量百分比比例为50:5:1～6:3:1，其中最优比例为18:5:1。

15、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

16、本发明所述的材料具备良好的生物相容性、体内安全性、抗压抗张能力（弹性模量或机械强度较高）和组织器官生成能力。一方面为体外生物型人工组织和器官制造创造条件，另一方面为病损组织器官，包括糖尿病创面（dws）、肿瘤切除空缺部位、硬组织器官（如粉碎性骨折）、软组织器官（如脂肪组织、压疮、痔疮），修复及美容整形（矫形）提供新的治疗方法和手段。