一种腺病毒吸入疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及疫苗，具体涉及一种腺病毒吸入疫苗及其制备方法和应用，更具体而言，涉及一种黏膜给药的重组腺病毒载体疫苗的制备方法及其应用。

背景技术：

1、上个世纪20年代，人们就开始尝试采用气溶胶方式给药治疗某些疾病。然而由于气溶胶发生技术原因，吸入治疗很难达到预期的效果，这种给药途径一直受到争议。雾化气溶胶吸入的给药方式受到越来越多的重视。

2、对于绝大多数多肤、蛋白及其它大分子物质，胃肠道、鼻腔及肺组织气道上的圆柱形上皮细胞是不能直接垂直渗透这些物质的。但是位于肺气道深部非常微小的肺泡上皮细胞却能让某些大分子物质透过。多肤、蛋白质和核酸的呼吸道给药治疗在药物给药方法的研究中是个快速发展的新领域，虽然气溶胶发生技术仍处于发展阶段，多肤、蛋白和核酸的呼吸道给药还是有很大的发展前景的。

3、呼吸道气溶胶免疫的优越性及不足气溶胶呼吸道给药的免疫方式现今倍受研究者的关注，主要是因为它有较其它免疫途径的凡点优越性:方便有效、无创性、交叉感染少。气溶胶吸入免疫是一种有前景的免疫途径，特别适合儿童和老人。它较鼻腔滴入有其独特的优越性，不会给患者带来痛苦和不便，易于让患者接受。进入肺脏的分子不仅可以诱发局部粘膜的免疫反应，甚至可能诱发异位粘膜的免疫反应。

4、人们己经知道，肺组织允许大分子物质通过，但是同时，想要完全弄清楚吸入物质的生物利用度是比较难的，因为气溶胶的沉积速度和给药剂量、气溶胶的浓度及在鼻咽部和呼吸道粒子(或小滴)大小的分布都是决定性的问题。因此，通过呼吸道给药的治疗方法还是存在不少问题。

5、呼吸道气溶胶给药要求合适的技术。研究表明，胃肠道、鼻腔及皮肤粘膜对生物制剂的吸收形成强有力的屏障。

6、气溶胶的发生装置有待改进，粗糙的设备导致了较低的药物浓度，对剂量的稳定性也有影响。尽管呼吸道深部有巨大的表面积(成人142m2)，而且有渗透特性，但是想要在肺泡局部达到有效的药物浓度还是有难度的。事实上，目前现有的气溶胶装置发生效率太低，而且未标准化，对于不同的病人剂量的稳定性会变化，这些都是岌待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明涉及一种雾化吸入疫苗，具体涉及一种重组腺病毒载体雾化吸入疫苗和制备方法及其应用。本发明的雾化吸入疫苗可以同时表达一种或多种抗原。在对机体进行吸入黏膜免疫后，不仅可以同时在肺部和机体内产生高水平特异性抗体，还可以刺激产生很高的细胞免疫反应。另外，本发明中的疫苗为吸入给药制剂，可以有效激发黏膜免疫，增加机体的第三重保护。本发明提供的重组腺病毒载体疫苗具有良好的稳定性、安全高效且无痛，可以有效对细菌、病毒的新发感染和潜伏感染的复发。

2、本发明的一方面，提供一种雾化吸入制剂，所述制剂包含有效成分，所述有效成分为表达抗原蛋白的重组腺病毒，所述制剂中溶质分子的渗透浓度为：300-750mosmol/kg；具体的，所述制剂中溶质分子的渗透浓度包括但不限于为300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、700、725或750mosmol/kg。

3、优选的，所述制剂中溶质分子的渗透浓度为325-725mosmol/kg；具体的，所述制剂中溶质分子的渗透浓度包括但不限于为325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、700或725mosmol/kg。

4、更优选的，所述制剂中溶质分子的渗透浓度为375-625mosmol/kg；具体的，所述制剂中溶质分子的渗透浓度包括但不限于为375、400、425、450、475、500、525、550、575、600或625mosmol/kg。

5、在一些具体实施方式中，所述溶质分子包括糖、盐、金属离子螯合剂、保护剂和/或表面活性剂。

6、在一些具体实施方式中，所述盐的含量为25-75mm，所述盐类选自氯化钠、氯化镁、氢卤化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、枸橼酸盐、甲苯-磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐和对氨基水杨酸盐中的至少一种或两种。

7、在一些具体实施方式中，所述糖类选自蔗糖、海藻糖、岩藻糖和/或麦芽糖中的至少一种或两种。

8、在一些具体实施方式中，所述糖类的含量为20-75mg/ml；具体的，所述糖的含量包括但不限于为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75mg/ml。

9、在一些具体实施方式中，所述保护剂选自山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇中的至少一种或两种。

10、在一些具体实施方式中，所述保护剂的含量为20-75mg/ml；具体的，所述保护剂的含量包括但不限于为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75mg/ml。

11、在一些具体实施方式中，所述糖、盐和保护剂含量的总和低于500mm。

12、在一些具体实施方式中，所述表面活性剂选自吐温、司盘、甘油中的一种或者多种；优选的，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、司盘20、司盘80中的至少一种或两种。

13、在一些具体实施方式中，所述表面活性剂的浓度为0.01-5.0mg/ml；具体的，所述表面活性剂的浓度包括但不限于为0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml。

14、在一些具体实施方式中，所述金属离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)，乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，氨基三乙酸(又称次氮基三乙酸nta)，二亚乙基三胺五乙酸及其盐、柠檬酸(ca)、酒石酸(ta)和/或葡萄糖酸(ga)中的至少一种或两种。

15、在一些具体实施方式中，所述制剂的ph值为1～14，具体的，所述制剂的ph值包括但不限于为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14；优选的，所述制剂的ph值为5-8，具体的，所述制剂的ph值包括但不限于为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0；更优选的，所述制剂的ph值为6-7.5，具体的，所述制剂的ph值包括但不限于为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。

16、在一些具体实施方式中，所述制剂还包括缓冲剂；优选的，所述缓冲剂为hepes、his、tris、pb、琥珀酸、柠檬酸中的一种或多种。

17、在一些具体实施方式中，所述缓冲剂的浓度为1～15mm；具体的，所述缓冲剂的浓度包括但不限于为1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0mm。

18、在一些具体实施方式中，所述腺病毒为人腺病毒或黑猩猩腺病毒。

19、优选的，所述腺病毒为选自血清1型～血清57型的人腺病毒中的一种或多种。

20、在一些具体实施方式中，所述黑猩猩腺病毒选自由adc8,adc22,adc30,adc37,adc11,adc3,adc17,adc19,adc31,adc20,adc24,pan1,pan2,pan3,adc16,adc26,adc82,adc5,adc7,adc44,adc38,adc43,adc63,adc147,adc73,adc6,adc55,adc83,adc143,adc144,adc145,adc10,adc28,adc9,adc68构成的组；更优选的，所述黑猩猩腺病毒为adc6型、adc7型、adc63型或adc68型。

21、在一些具体实施方式中，所述腺病毒为复制缺陷型重组腺病毒。

22、在一些具体实施方式中，所述制剂中重组腺病毒的含量为1×108～1×1012vp/ml，具体的，所述制剂中重组腺病毒的含量包括但不限于为1×108vp/ml、2×108vp/ml、3×108vp/ml、4×108vp/ml、5×108vp/ml、6×108vp/ml、7×108vp/ml、8×108vp/ml、9×108vp/ml、1×109vp/ml、2×109vp/ml、3×109vp/ml、4×109vp/ml、5×109vp/ml、6×109vp/ml、7×109vp/ml、8×109vp/ml、9×109vp/ml、1×1010vp/ml、2×1010vp/ml、3×1010vp/ml、4×1010vp/ml、5×1010vp/ml、6×1010vp/ml、7×1010vp/ml、8×1010vp/ml、9×1010vp/ml、1×1011vp/ml、2×1011vp/ml、3×1011vp/ml、4×1011vp/ml、5×1011vp/ml、6×1011vp/ml、7×1011vp/ml、8×1011vp/ml、9×1011vp/ml、1×1012vp/ml；优选的，所述制剂中重组腺病毒的含量为5×109vp/ml。

23、在一些具体实施方式中，所述雾化吸入制剂的气溶胶颗粒的粒径：d90粒径为5.0-10.0μm；具体的，所述d90粒径包括但不限于为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0μm。

24、优选地，d90粒径为6.0μm、6.1μm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm、7.0μm、7.1μm、7.2μm、7.3μm、7.4μm、7.5μm、7.6μm、7.7μm、7.8μm、7.9μm、8.0μm、8.1μm、8.2μm、8.3μm、8.4μm、8.5μm、8.6μm、8.7μm、8.8μm、8.9μm、9.0μm，9.1μm、9.2μm、9.3μm、9.4μm、9.5μm、9.6μm、9.7μm、9.8μm、9.9μm。

25、具体地，空气动力学粒径mmad为1.5～6μm，优选地，为3.0～5.0μm，更优选地，3.1μm，3.2μm，3.3μm，3.4μm，3.5μm，3.6μm，3.7μm，3.8μm，3.9μm，4.0μm，4.1μm，4.2μm，4.3μm，4.4μm，4.5μm，4.6μm，4.7μm，4.8μm，4.9μm。

26、在一些具体实施方式中，所述雾化吸入制剂的气溶胶颗粒的粒径：d50粒径为2.0-7.0μm；具体的，所述d50粒径包括但不限于为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0μm。

27、优选地，d50粒径为2.5-4μm；优选地，2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm。

28、在一些具体实施方式中，所述雾化吸入制剂的气溶胶颗粒的粒径：d10粒径为0.5-2.50μm，具体的，所述d10粒径包括但不限于为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μm；优选地，d10粒径为0.7-1.5μm，具体的，所述d10粒径包括但不限于为0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5μm。

29、在一些具体实施方式中，气溶胶ngi fpf(细微粒子，fine particle fraction)小于5.39μm的粒子占所述雾化吸入制剂的沉积百分比不低于45％。

30、具体地，气溶胶ngi fpf(细微粒子，fine particle fraction)小于5.39μm的粒子占所述腺病毒载体疫苗吸入溶液的沉积百分比不低于45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，优选地，fpf为55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％。

31、具体地，气溶胶ngi fpf(细微粒子，fine particle fraction)小于3.30μm的粒子占所述腺病毒载体疫苗吸入溶液的沉积百分比不低于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％，优选地，fpf为25％、30％、35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％。

32、在一些具体实施方式中，气溶胶ngi fpf(细微粒子，fine particle fraction)小于3.30μm的粒子占所述雾化吸入制剂的沉积百分比不低于25％。

33、在一些具体实施方式中，空气动力学粒径mmad为1.5～6μm，具体的，包括但不限于为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0μm；优选地，为3.0～5.0μm，具体的，包括但不限于为3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0μm。

34、在一些具体实施方式中，所述重组腺病毒表达的抗原蛋白来源于病毒或细菌抗原，其选自：hiv、狂犬病病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、人乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、带状疱疹病毒(vzv)、巨细胞病毒、2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、感病毒、克氏锥虫和恶性疟原虫、结核杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、nthi嗜血流感菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体的一种或多种。

35、本发明的另一方面，提供一种制备上述任一制剂的方法，所述方法包括以下步骤：制备编码细菌或病毒的抗原的重组腺病毒载体，加入药学上可接受的辅料。

36、在一些具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：构建融合抗原序列；构建质粒；将所得重组腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的骨架质粒共转染至宿主细胞。

37、在一些具体实施方式中，所述方法还包括如下步骤：培养所述宿主细胞；收获从所述宿主细胞中释放的复制缺陷重组腺病毒；对所述的重组腺病毒进行扩大培养；对培养获得的重组腺病毒进行纯化；将纯化得到的重组腺病毒加入相应辅料，即得到该疫苗。

38、本发明的另一方面，提供一种如上述任一雾化吸入制剂、如上述任一方法在制备用于预防哺乳动物的传染性疾病的疫苗中的用途。

39、在一些具体实施方式中，所述疫苗通过黏膜免疫。

40、优选的，所述黏膜包括口腔黏膜或呼吸道黏膜。

41、优选地，所述溶剂为无菌注射用水。

42、优选地，所述制剂的单位剂量为0.05-5ml，优选地，0.1-1ml。

43、优选地，所述制剂组合中所述重组腺病毒的含量为1×108～1010gc/剂，优选地，1×108～2×1010gc/剂。

44、具体地，所述疫苗为黏膜免疫制剂；黏膜免疫制剂为滴鼻剂、气雾剂、喷雾剂、液体制剂、凝胶剂、微球剂、脂质体、混悬剂；

45、具体地，所述黏膜给药方式为鼻吸入或经口吸入；优选的，所述吸入给药方式为吸入液体制剂。

46、具体地，所述疫苗的单位剂量为0.05-0.5ml。

47、本发明相比现有技术的有益效果为：

48、本发明的腺病毒吸入制剂。解决了1)皮下注射的疫苗和肌肉注射的疫苗不能诱导持续的粘膜免疫和肺部免疫；2)其他递送形式的疫苗不能靶向免疫肺部巨噬细胞；3)其他递送形式的疫苗不能利用腺病毒载体作为安全的天然i型佐剂在肺部增强疫苗的免疫应答；4)不能抑制潜伏感染的复发问题

49、本发明的一个方面，本发明腺病毒吸入制剂利用呼吸道黏膜递送的方式给药，较注射不仅具有顺应性，而且给药剂量更低，还可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重免疫效果。本发明提供的疫苗组合物可以用于基础免疫或加强免疫。

50、本发明的一个方面，本发明疫苗经适宜的设备雾化后，可产生2～10μm之间，优选地，2.0～6μm粒径均一度较佳的气溶胶颗粒。其经鼻腔或口腔吸入可到达肺部，从而产生对整个呼吸道，以及肺部的保护性免疫反应，增强疫苗的有效利用率，提高疫苗的效果。

51、本发明的一个方面，本发明腺病毒吸入制剂稳定，可在较长时间内维持病毒活性。