MIR2911在制备抗日本脑炎病毒JEV的药物中的应用

本技术涉及生物制药，具体涉及mir2911在制备抗日本脑炎病毒jev的药物中的应用。

背景技术：

1、日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus，jev)又称流行性乙型脑炎病毒，属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属，是一种蚊媒性的人畜共患病病原。jev主要靶向中枢神经系统，引起神经细胞损伤和强烈的炎症反应，是造成病毒性脑炎的最主要病原体之一，儿童是该疾病的主要受害者。jev感染人后大约有5-15天的潜伏期，初期症状表现为高热、恶心、呕吐以及头痛，随后症状逐渐加重出现意识障碍、行为异常，重症患者可出现神经麻痹、强直性痉挛、四肢瘫痪和小脑及神经功能损伤。

2、jev主要流行于大部分亚洲地区，但近年来感染范围不断扩大，全球每年约有68000例日本脑炎。现如今，约有30亿人生活在jev流行地区，致死率高达30％，即使幸存也有可能留下神经系统或心理后遗症，给社会公共卫生安全带来了沉重的负担。目前还没有针对jev临床治疗的特定药物，接种疫苗仍然是预防乙脑病毒感染最有效的方法。目前，市售的针对jev的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，其中灭活疫苗具有多剂量接种导致的副作用大、免疫原性差等缺点，减毒活疫苗具有毒株返强的潜在威胁性。由于疫苗覆盖率的限制及免疫策略的失败，大约80％的乙脑病毒感染病例发生在疫苗接种计划覆盖的地区，亟需研发一种治疗效率高、副作用小的新型安全有效的预防和治疗策略。

3、rna干扰(rnai)疗法自诞生以来一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前景的策略。mir2911作为金银花中一种具有广谱抗病毒潜力的新型核酸类有效成分，其碱基组成上具有高gc含量，生物信息学预测它能够靶向94％已知的病毒，目前已被证实能够抑制埃博拉病毒、甲型流感病毒、非洲猪瘟病毒及新冠病毒等多种病毒，但尚未有研究证实mir2911能否对jev引起的疾病有效。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术局限性，本技术提出了mir2911在制备抗日本脑炎病毒jev的药物中的应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

2、申请人的研究团队前期研究发现，经口服吸收外源的microrna通过胃粘膜胃顶细胞的sidt1蛋白转运到细胞内，通过外泌体运输进入循环系统，进入受体细胞调控目的基因的表达；然而，由于16％的中国人群有sidt1基因多态性导致无法经口服吸收mir2911，故此，研究团队进一步研发了体内自组装第三代小核酸技术，使其成为一种安全有效的sirna递送系统，结合自主研发的高效表达mir2911的质粒递送系统，开发生物合成mir2911小核酸药物，能够为靶向jev提供潜在策略并补偿口服吸收mir2911的个体差异。

3、为实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

4、本技术的发明点是提供了mir2911在制备抗日本脑炎病毒jev的药物中的应用。

5、mir2911是一类植物来源的天然功能性小分子，具有跨界调控非植物靶基因的功能，安全且高效。

6、可选地，所述的应用中，mir2911是来源于基因组件中的，所述基因组件包括用于表达mir2911序列的dna序列以及与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

7、可选地，所述的应用中，所述表达mir2911的dna编码链序列(5′-3′)如seq idno.1所示，所述表达mir2911补偿序列(5′-3′)的dna编码链序列为如seq id no.2所示的序列。为了使mir2911更易表达，对补偿序列上的碱基进行突变从而降低mir2911与补偿序列的结合能。更优的，补偿序列(5′-3′)如seq id no.3所示，从注射后外泌体内表达的mir2911的定量检测中得出此结论。

8、seq id no.1：

9、ggccgggggacgggctggga。

10、seq id no.2：

11、tcccagcctcccccggcc。

12、seq id no.3：

13、ttttagccttttttggcc。

14、可选地，所述的应用中，所述基因组件还包括loop序列；所述基因组件的组成顺序为表达mir2911序列的dna序列-loop序列-与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

15、可选地，所述的应用中，所述loop序列(5′-3′)为seq id no.4所示的序列。

16、seq id no.4：

17、gttttggccactgactgac。

18、基因组件整体按照mir2911序列-loop序列-补偿序列排列；

19、如seq id no.5所示(对应补充序列seq id no.2)：

20、ggccgggggacgggctggga-gttttggccactgactgac-tcccagcctcccccggcc；

21、或如seq id no.6所示(对应补充序列seq id no.3)：

22、ggccgggggacgggctggga-gttttggccactgactgac-ttttagccttttttggcc。

23、可选地，所述的应用中，所述mir2911是源自递送系统中的，所述递送系统含有所述的基因组件，递送系统能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有mir2911序列的复合结构。

24、可选地，所述的应用中，所述递送系统为病毒载体或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。

25、可选地，所述的应用中，所述递送系统还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在被施用对象的器官组织中形成复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述mir2911序列递送进入目标组织；

26、优选的，所述递送系统包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子与表达mir2911序列的dna序列、启动子与靶向标签、启动子与表达mir2911序列的dna序列与靶向标签；

27、优选的，所述复合结构为外泌体。

28、递送系统按照启动子-靶向标签-基因组件排列。

29、可选地，所述的应用中，所述启动子为cmv启动子，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白；

30、优选的，所述靶向肽包括rvg靶向肽、ge11靶向肽、ptp靶向肽、tcp-1靶向肽、msp靶向肽；更优选的，选自rvg靶向肽，狂犬病病毒肽rvg能穿过血脑屏障，进入脑组织，使小核酸在脑内发挥作用，对于针对脑部疾病的小核酸治疗有重要作用；

31、优选的，所述靶向蛋白包括rvg-lamp2b融合蛋白、ge11-lamp2b融合蛋白、ptp-lamp2b融合蛋白、tcp-1-lamp2b融合蛋白、msp-lamp2b融合蛋白；更优选的，选自rvg-lamp2b融合蛋白。

32、通过靶点预测发现，mir2911可以直接靶向jev-env、jev-ns5、jev-ns4b、jev-m、jev-ns3等多个基因的核酸序列，由于ns3蛋白是jev复制所必需的，优选为jev-ns3，在细胞水平上能抑制jev p3毒株的复制，细胞水平包括但不限于在bhk-21、neuro-2a、sh-sy5y细胞中起到抑制jev p3毒株复制的作用。

33、此细胞水平上抑制jev p3，包括在mrna、蛋白质和病毒颗粒三个水平上的复制。

34、本技术的第二个发明点是提供了一种抗日本脑炎病毒jev的药物组合物，所述药物组合物中包括所述的mir2911、所述的基因组件或所述的递送系统；还含有药用辅料；所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。

35、此种药物，可在体内自组装形成包裹mir2911的外泌体，随后进入血液循环进而将mir2911递送至各个组织。

36、本技术还提供了一种体外抑制jev复制或抑制jev蛋白基因表达的方法，通过将人工合成的含有mir2911的质粒与受jev感染的细胞进行接触实现抑制作用。

37、与现有技术相对比，本技术具有以下优点：本技术提供的mir2911在制备抗日本脑炎病毒jev的药物中的应用，创新性地提出了应用一种mir2911小核酸药物抑制jev复制的新型策略，能够特异性地靶向jev的多个基因，与利巴韦林相比，更有效地在体外抑制jev的复制。细胞实验证明，该小核酸药物能够直接靶向jev基因，能够在mrna、蛋白质和病毒颗粒三个水平显著抑制jev的复制，且优于利巴韦林的效果。动物实验证明，合成的功能性mir2911不仅能够有效预防日本脑炎的发生，而且在日本脑炎的发生早期进行给药，能够有效预防疾病的发生发展，晚期用药能改善乙脑症状，拖延死亡时间，起到预防和治疗jev感染的效果。质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好，最终发挥效果的rna序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性，而且能够补偿口服mir2911的个体差异。mir2911能直接靶向jev的多个基因，能够有效应对病毒基因组突变，与市面上具有单一靶点的蛋白多肽类药物相比，成本低廉且更加高效。此外，mirna的生产工艺简单，设计灵活多变，应用功能强大，为靶向其他病毒或治疗目前其他传统疗法无法治愈或效果不佳的疾病提出了一种代替方法，应用前景广阔。