一种嵌合表达OmpUT-LptDEP联合抗原的弧菌基因工程活菌疫苗及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种嵌合表达omput-lptdep联合抗原的弧菌基因工程活菌疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、我国是水产养殖大国，水产养殖业发展迅速。随着水产养殖的不断扩大，水产养殖动物病害频繁发生，其中以副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)等弧菌引起的弧菌病(vibriosis)最为严重，对规模化养殖和发展造成了巨大的威胁，严重制约着水产养殖业的可持续健康发展。副溶血弧菌是一类常见的革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地沿海地区的河口和沿海水域，其最适生长环境为ph7.6～8.6，盐度为2～3，温度30～37℃。由该菌感染所引起的鱼、虾、蟹及贝类等的弧菌病是水产养殖动物最普遍流行且危害最大的细菌性疾病。同时，副溶血弧菌在我国仍是主要的食源性病原菌，夏秋季节是其导致食物中毒的高发阶段，人感染后会出现恶心、头痛、低烧、呕吐、腹泻等症状，严重的还会诱发肠胃炎或败血症。

2、目前对弧菌的预防和治疗主要是依靠抗生素，但因长期大量使用抗生素，已引起抗药性，且导致抗生素在动物体内的富集，对人类健康造成危害。近年来的研究表明暴露于细菌外表面的外膜蛋白具有良好的免疫原性及抗原性。因此，基于外膜蛋白为抗原以研制疫苗来防治细菌性疾病是一种安全有效的方法，与其它防治途径相比，以疫苗为主的免疫防治有不可替代的优势。因而利用具高效保护性外膜蛋白来研制重组载体活细菌疫苗具有广阔的市场前景。

3、定位于副溶血弧菌外膜的跨膜蛋白ompu为一种孔蛋白(porin)，其分子量约为34.3kda，为高丰度外膜蛋白，其功能为允许小分子通过其在外膜中被动扩散。近年来的研究表明，ompu为水产养殖动物识别细菌感染的关键蛋白之一，而且也是细菌生物膜基质中常见的外膜蛋白，可通过影响弧菌多糖的形成来影响生物膜的结构，对生物膜的形成至关重要。ompu也是致病弧菌中的一种保守的外膜蛋白，研究表明能引起有效的保护性免疫反应，被认为是开发疫苗的重要保护性抗原。

4、同样定位于副溶血弧菌外膜的跨膜蛋白lptd(lps-assembly protein)的分子量约为86.6kda，其在外膜中的丰度极低。lptd是负责转运脂多糖(lps)跨过外膜并在细菌外表面组装的关键蛋白。脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分之一，也被称为内毒素，它不仅有助于细菌抵御恶劣的环境和外界的毒素(包括抗生素)，也是细菌感染导致炎症和人体天然免疫反应的原因之一。因而lptd对细菌的生理功能和毒力均具有关键作用，被认为是革兰氏阴性细菌存活的“命门”。目前，研究表明lptd具有极强的免疫保护性。同时，其抗体通过与细菌lptd结合，阻止lps转运，影响细菌外膜通透性，显著提高细菌对疏水性抗生素的敏感性。与ompu类似，lptd的氨基酸序列在至少23种弧菌中保守，因而该蛋白是极具发展前景的疫苗靶点。但由于lptd在外膜中的丰度较低，难以作为主要抗原诱发机体免疫反应。

5、同时，尽管当前人们已认识到以疫苗为核心的免疫防治是控治水产养殖业病害的必由之路，但因水产养殖动物病原菌种类繁杂、血清型多样，不可能对所有病原菌及其血清型逐一进行疫苗预防接种。因此，急需开发一种多血清型的弧菌疫苗。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高表达omput-lptdep联合抗原的弧菌基因工程活菌疫苗及其制备方法和应用。

2、因此，本发明一方面公开了一种弧菌基因工程活菌疫苗，所述疫苗含有能稳定表达omput-lptdep联合抗原基因的副溶血弧菌vp6，其中副溶血弧菌vp6由副溶血弧菌vp3通过基因改造和筛选而来，副溶血弧菌vp3中编码ompu蛋白318-337氨基酸的基因被lptdep基因替换。

3、优选地，本发明所述omput的氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

4、优选地，本发明所述lptdep基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、再一方面，本发明还公开了一种所述的副溶血弧菌vp6的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

6、(1)首先以副溶血弧菌o3:k6菌株基因组dna为模板，分别利用引物ompu’-up-f/r和ompu’-down-f/r分别扩增ompu’基因片段的上游、下游同源臂序列，然后将其上、下游同源臂与lptdep基因序列作为模板，以引物ompu’-up-f/ompu’-down-r进行融合pcr，得到融合片段up-lptdep-down，将融合片段与质粒pre112连接，得到重组质粒pre112-up-lptdep-down；

7、(2)将该重组质粒先转化至大肠杆菌s17-1λpir，再通过接合转移法导入副溶血弧菌vp3中，在蔗糖的压力下进行传代培养，使用ompu’-f/r、up-lptdep-f/r和sacb-f/r进行菌液pcr验证，筛选出成功交换上下游同源臂的菌株后，将其涂布于含有15％蔗糖的tcbs平板，37℃倒置培养至长出单菌落；

8、(3)将得到的菌株用ompu’-f/r、up-lptdep-f/r和sacb-f/r引物进行菌液pcr验证：以ompu’-f/r和sacb-f/r为引物不能扩增出目的条带，而以up-lptdep-f/r为引物可以扩增出相应条带，表明成功获得lptdep基因替换的可表达omput-lptdep联合抗原的弱毒菌株，命名为副溶血弧菌vp6。

9、优选地，本发明所述的各引物序列如下所示：

10、ompu’-up-f：tgctctagacagacacaggtcttgagct；

11、ompu’-up-r：ttttatcgctgttgaggtagttgccaccaactttac；

12、ompu’-down-f：cctctcctgaatactaattccagtctttagacttg；

13、ompu’-down-r：cgagctcgctgtcccctaactctaat；

14、ompu’-f：ctacagcatctaaagctgatgc；

15、ompu’-r：gaagtcgtaacgtagacctagag；

16、up-lptdep-f：cgagctcgctgtcccctaactctaat；

17、up-lptdep-r：gtattcaggagaggagcccgta；

18、sacb-f：tacctgccgttcactattatttagtg；

19、sacb-r：ggcgtgtaatatgggaaatgc。

20、再一方面，本发明还公开了一种所述的副溶血弧菌vp6在制备弧菌基因工程活菌疫苗中的应用。

21、本发明基于丰度高和具免疫保护性的ompu和具有强免疫保护性的lptd的抗原表位相偶联的联合抗原omput-lptdep来开发安全有效以及使用方便的新型重组活细菌疫苗，该重组活细菌的基因组中整合有高效表达omput蛋白和lptd抗原表位的基因，且该基因具有良好的稳定性，连续传代50代均没有丢失，同时对弧菌的正常生长没有影响。

22、本发明的重组弧菌活疫苗通过浸泡免疫后对弧菌均有良好的免疫保护作用。因此，该疫苗可为水产养殖动物弧菌病的控制以及水产养殖业的健康发展提供良好的保障。

23、需要特别说明的是，本研究在构建高效表达联合抗原菌株时，发现以其他丰度较高的外膜蛋白(如ompk等)作为与lptdep抗原表位的偶联蛋白时，联合抗原表达量不够高，且其免疫后效果不佳；为此，本发明人筛选到ompu蛋白，且对ompu进行分析和筛选其与lptdep的偶联部位时，筛选到omput(ompu1-317氨基酸)，这不影响ompu的功能及其免疫原性，且与其偶联的lptdep分布在外膜的外表面，此时高表达的omput-lptdep具有良好的免疫原性，且构建到弧菌中稳定、目的蛋白表达量高，免疫后具有良好的免疫效果。同时，lptd蛋白在一开始的研究中因其分子量较大、蛋白疏水性高，ompu与完整lptd蛋白偶联后存在表达及免疫原性不够好的问题，为此，本发明人对lptd蛋白进行分析，从中筛选的四个抗原表位肽偶联后具有良好的免疫原性，且构建到弧菌中稳定、目的蛋白表达量高，免疫后具有良好的免疫效果。