一种机械响应bFGF控释水凝胶的制备方法及应用

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种机械响应bfgf控释水凝胶的制备方法及应用。

背景技术：

1、鼓膜穿孔（tympanic membrane perforation，tmp）是临床最常见耳科疾病，常由反复中耳感染、外伤、医源性损伤等原因所致。临床上，约80%的急性tmp能够自愈，但仍有20%左右患者不能愈合，当穿孔迁延不愈3月以上，将演变成为慢性tmp。慢性tmp可导致听力下降和反复耳漏，甚至可导致颞骨内并发症（例如迷路炎、周围性面瘫、bezold脓肿等）和颅内并发症（例如硬膜外脓肿、乙状窦血栓性静脉炎、脑膜炎、脑脓肿等），若发生颅内感染甚至可危及生命。

2、目前，鼓室成形术是慢性tmp最主要治疗方式，手术旨在重建鼓膜正常结构和声学振动传导机制，手术中采用颞肌筋膜、耳屏软骨、软骨膜及脂肪等自体材料来修复穿孔鼓膜。然而，自体材料手术修复方式通常具有需要全麻、术区扩大切口取材、再次手术取材困难、手术麻醉风险、以及费用较高的缺陷。生长因子疗法是一种极具潜力的治疗方法，由于碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bfgf）可通过促进细胞增殖、迁移以及扩张血管等机制促进tmp愈合，目前临床常采用明胶海绵负载bfgf治疗tmp。然而，bfgf半衰期较短、稳定性较差，以及过高剂量则可抑制纤维层胶原合成，上述缺陷制约其在tmp中的应用。因此，目前急需构建一种可负载bfgf的支架材料，实现bfgf的精准递送和长效可控释放。然而，传统载药支架常常仅考虑其在静止状态中的疗效。事实上，鼓膜常处于声波和声压的持续作用下，其实时发生形变并将不同频率声波转化为振动。由于多数支架材料在持续动态环境下，难以维持其力学强度、功能稳定性及组织粘附性，从而影响或延迟穿孔愈合，并可致反复耳漏和听力下降。因此，鉴于鼓膜穿孔部位的持续机械振动环境，研发一种能够机械响应释放生长因子、同时具有良好组织粘附性和生物相容性的生物医用材料具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种机械响应bfgf控释水凝胶的制备方法及应用，本发明制备的bfgf控释水凝胶能够机械响应释放生长因子、同时具有良好组织粘附性和生物相容性，将其作为鼓膜穿孔的修复材料使用时能够适应鼓膜所处的持续机械振动环境，不但能维持其力学强度、功能稳定性及组织粘附性，而且可利用机械振动的刺激而控制bfgf的释放以促进细胞迁移和增殖，从而达到良好的治疗效果。

2、本发明以海藻酸盐（sodium alginate， sa）、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（sulfobetaine methacrylate，sbma）和甲基丙烯酰明胶（gelatin methacrylate, gelma）为原料，采用高压静电喷射技术制备负载bfgf的sa微球，随后通过简单物理包埋将微球均匀分散于sbma/gelma水凝胶预聚液中，采用光交联法成胶，籍此制备了具有快速响应能力的机械响应bfgf控释水凝胶（sgm水凝胶）。该水凝胶具有良好的力学性能、组织粘附性能、以及机械响应性能。此外，其还具有良好的生物相容性，可通过释放具有生物活性的bfgf以促进细胞迁移和增殖，且振动能够促进bfgf释放。该机械响应型水凝胶展现出了应用临床治疗tmp的潜力。

3、本发明的技术解决方案如下：一种机械响应bfgf控释水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、1）sa微球的制备：将bfgf溶于sa溶液内，静电喷射制备得到负载bfgf的sa微球；

5、2）sbma/gelma水凝胶预聚液的制备：在 sbma溶液中加入gelma，而后与pegdma和irgacure 2959混合得到sbma/gelma水凝胶预聚液；

6、3）将步骤1）制备的sa微球均匀分散在sbma/gelma水凝胶预聚液中，充分混匀后，在波长为365 nm紫外线光源下照射得到机械响应bfgf控释水凝胶。

7、作为优选，所述gelma通过以下步骤制备：在50℃下，明胶溶解于磷酸盐缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐，3h后加入磷酸盐缓冲溶液终止反应，在40°c下透析，冷冻干燥得到gelma。

8、所述sa溶液为海藻酸盐溶液。具体地，所述sa溶液为海藻酸钠溶液。

9、作为优选，步骤1）中，所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠浓度为1-2 wt%；所述bfgf在海藻酸钠溶液内的含量为0.2ug/ml。

10、作为优选，所述静电喷射具体为电压10-20 kv，注射速度为0.5-5 ml/h的高压静电喷射技术。

11、作为优选，所述sbma/gelma水凝胶预聚液中甲基丙烯酰明胶（gelma）的浓度为2.5-10 wt%。

12、作为优选，所述sbma/gelma水凝胶预聚液中磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（sbma）的浓度为1-1.5g/ml。

13、作为优选，所述sbma/gelma水凝胶预聚液中聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（pegdma）的浓度为0.10-0.15wt%。

14、作为优选，所述sbma/gelma水凝胶预聚液中2-羟基-4,-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯基丙酮（irgacure 2959）的浓度为0.5-1.0wt%。

15、作为优选，步骤3）制备的机械响应bfgf控释水凝胶中，所述sa微球含量为2.5-10wt%。

16、本发明还提供一种机械响应bfgf控释水凝胶的应用，用于制备治疗鼓膜穿孔的鼓膜支架。即作为医用材料用于制备鼓膜穿孔的修复材料。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制备的水凝胶可在持续鼓膜振动刺激下，以机械响应方式促进负载的bfgf释放，从而促进tmp愈合和听力康复。

18、本发明中sa是从褐藻中提取的天然多糖，具有良好稳定性和生物相容性，被广泛用于组织工程和再生医学领域，包括细胞载体、创面敷料及药物载体等。据报道，智能水凝胶尺寸越小，其响应速率则越快，故本发明通过设计具有微球复合结构的水凝胶，以达到提高智能水凝胶响应能力目的。采用高压静电喷射技术主要优点是微球形成过程发生于较温和条件下，无需高温或使用化学交联剂，不影响生长因子的生物活性，且操作简单、可控性强，可生产球形、单分散且直径可调的微球等。

19、本发明中的sbma的自聚物-聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（poly sulfobetainemethacrylate, psbma），通过离子-偶极子和偶极子-偶极子相互作用对组织具有优异的粘附性。且有研究证实，sbma水凝胶可通过促进血管生成、降低炎症反应和调节巨噬细胞极化来促进急性创面愈合。此外，polysbma还具有良好生物相容性、无免疫原性等优点，因此成为蛋白质药物输送系统的首选替代材料。上述甲基丙烯酰明胶（gelma）是通过引入甲基丙烯酸酯基团对明胶进行改性得到，其具有光交联特性。在水凝胶中加入gelma可增强水凝胶机械性能、生物活性和组织亲和性。

20、本发明水凝胶具有良好的机械力学性能和组织粘附性能。尤其可通过机械振动刺激而控制bfgf释放，而且振动不会对水凝胶的力学性能产生明显影响，这表明该水凝胶具有机械响应性能。体外细胞毒性实验表明，该水凝胶具有良好生物相容性；免疫荧光和划痕试验表明，负载bfgf水凝胶能释放具有生物活性的bfgf以促进细胞迁移和增殖，而且振动能够促进bfgf释放。

21、本发明利用海藻酸钠微球作为bfgf载体，并对智能微球进行简单物理包埋，使其嵌入sbma/gelma水凝胶网络结构内，籍此制备了具有快速响应能力的水凝胶，并提出“振动-变形-释放”的响应机制。该水凝胶具有良好的力学性能、组织粘附性和生物相容性，其适配鼓膜独特的动态机械环境，可在持续鼓膜振动刺激下，以机械响应方式释放负载的bfgf。因此，临床可通过给予不同频率的听觉刺激来控制药物释放，精准控制药物释放剂量，从而满足不同愈合阶段的药物需求，促进tmp愈合和听力康复。