评价美拉德反应产物对机体免疫系统损伤的方法与流程

本发明属于食品评价，具体涉及一种评价美拉德反应产物对机体免疫系统损伤的方法。

背景技术：

1、美拉德反应(maillard reaction)是氨基化合物(胺、氨基酸、肽和蛋白质)和羰基化合物(糖类)自然发生的反应，也称之为非酶褐变。从营养学的角度考虑，乳制品中含有丰富的蛋白质和还原糖，在热处理过程中易发生美拉德反应，该反应使食品中的有效成分(如氨基酸类和糖类)损失并可引起食品的褐变。乳制品中乳蛋白的赖氨酸残基，酪蛋白的赖氨酸残基，都具有很高的反应活性，与还原糖——乳糖反应使大量氨基酸，如赖氨酸被束缚和破坏，导致牛奶和乳制品的营养价值明显降低。此外，美拉德反应也会产生一些羟甲基糠醛(hmf)、呋喃等对人体有害的物质。同时，有研究表明，美拉德反应产物与免疫刺激作用和免疫系统有关，多种模式识别受体对美拉德反应产物具有潜在的识别能力和结合亲和力，其相互之间的作用可能引发各种应答反应。由于婴幼儿免疫系统尚处于发育之中，对于婴幼儿乳制品中的美拉德反应产物应更加注意。因此，了解和掌握乳及食品如乳制品加工过程的美拉德反应及其产物对于保证食品的质量是非常有意义的。

2、引用文献1公开了一种低5-羟甲基糠醛含量的褐色酸奶及其制作方法，以纯净水、脱脂奶粉、酪蛋白酸钠和稳定剂为原料，经美拉德反应，再经过乳酸菌发酵得到褐色酸奶；美拉德反应条件为：加热温度为95-98℃，加热时间为150-180min；所述脱脂奶粉、酪蛋白酸钠和稳定剂的质量比为(10-12):(1.5-2):(0.15-0.25)；其中5-羟甲基糠醛含量可降低85％，在保证美拉德风味的同时提升产品的质量与安全性能。引用文献2公开了一种乳品中美拉德反应程度的判定方法，包括：(1)对所述乳品进行酸处理，得到糠氨酸待测溶液，采用液相色谱法测定所述糠氨酸待测溶液中的糠氨酸含量fu；(2)对所述乳品进行提取糠醛类物质处理，得到糠醛类物质待测溶液，采用气相色谱质谱法测定所述糠醛类物质待测溶液中的糠醛类物质含量hmf；(3)计算所述fu与hmf的比值，并通过比值判定乳品中美拉德反应程度。适用于奶粉、生乳、巴氏杀菌乳、超高温瞬时杀菌乳、复原乳和酸奶等多种乳品的美拉德反应程度的判定。引用文献3公开了一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中糠氨酸、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、呋喃甲基酮、甲基糠醛6种美拉德反应产物的方法，样品经水和草酸溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白后，采用eclipse xdb-c18色谱柱分离，以乙腈-0.1％三氟乙酸溶液为流动相，以流速0.6ml/min进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。

3、近年来，市场对于乳制品中有关美拉德反应的要求越来越严格，但是由于反应复杂，中间产物很多，很难对美拉德反应及其产物进行系统性的评价，单纯对时间和受热强度的控制，不足以有力的支撑市场需求，新的可以衡量美拉德反应的评价方式具有极大的意义。

4、此外，斑马鱼是体外受精发育的物种，其胚体透明，胚胎发育快，受精后约3天孵化，约5天开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。2002年，斑马鱼成为继人和小鼠之后第三个完成全基因组测序的脊椎动物，斑马鱼跟人的基因相似性>85％，目前已有机构将斑马鱼列为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物。斑马鱼作为“水中小白鼠”，与常规的哺乳动物相比，斑马鱼的优势主要有：①实验周期短(1-3天)、②费用低(约为小鼠的1/3-1/10)、③效率高(可在96孔中进行实验)、④透明易观察(可不解剖进行活体观察)、实验用药量小(10mg左右)。同时，斑马鱼不仅具有体外实验时间短、效率高、费用低的优势，还具有哺乳动物结果预测性强、可比度高等优点，是体外实验和哺乳动物之间的一个很好的桥梁。

5、引用文献：

6、引用文献1：cn110477101b；

7、引用文献2：cn115389642a；

8、引用文献3：cn116660434a。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、目前，现有技术中已存在例如上述引用文献等对美拉德反应程度进行控制、判定或对美拉德反应产物进行测定的方法，其主要通过控制美拉德反应的原料、温度和时间来控制反应产物，或利用分析化学的手段如液相色谱等检测美拉德反应的具体产物从而判定反应程度。

3、然而，尽管美拉德反应的产物已可以通过多种手段进行测定，但这些通过测定产物种类和含量来控制或判断美拉德反应程度的方法并不足以指导市场中实际的相关食品的生产或质量控制。

4、经过长期的研究，本发明认为，针对美拉德反应产物在食品中对于生物体的影响评价应当主要考量以下四个问题：第一，应当研究哪些美拉德反应和产物具有主要的代表性，尤其对于研究的细分领域；第二，这些代表性的美拉德反应产物具有现实的可获得性；第三，这些代表性的美拉德产物是否具有合适的生物学试验能够实证其对于生物体具有风险；第四，对于确定的研究方法的合理性是否具有便利的可验证性。

5、具体而言，本领域公知的是，美拉德反应产物众多，其中不乏对产品有益的例如可以提升产品风味、外观的物质，并且，在食品领域的很多工艺中也存在众多利用美拉德反应产物增加风味的情况，因此，面对众多的美拉德反应产物，对于其对生物是否有害不能一概而论。例如，一些研究对于某种情况下的大量的美拉德反应产物进行了分析或表征，但仅仅依据这些物质的总含量的高低或特定种类物质的含量高低来判断其生物风险性的逻辑是粗糙的，实际上是不合理的默认了所有美拉德反应产物均具有生物风险。

6、进一步，实证研究的基本原则出发，其前提之一在于研究对象应当具有代表性，也就是说，对于食品领域而言，尤其对于食品细分领域而言，应当确定其广泛存在的美拉德反应所产生的化学物质，这就需要进行相关的统计和比对。并且，当确定了典型性化学物质后，从研究的可行性角度考虑，也应当考察这些物质是否具有实际可获得的可能，只有实际可工业合成/获得的物质，才具有较强的进一步生物学实证的可行性。

7、进一步，对于合适的生物学实验，应当具有人体关联性，并且，实证中其应当可以通过某种方式而能够实现风险等级的划分或评判。

8、进一步，通过上述的评判方法得出的结论，应当可以通过较为简便的，尤其是已经存在的另外的标准或结论等进行验证。

9、基于上述考量，本发明针对食品领域的特点，尤其是乳制品的特点，本发明筛选了具有代表性的美拉德反应产物，并结合工业可实际获得性，而确定了2-糠醛、5-羟甲基糠醛、2-呋喃甲基酮或乙二醛作为生物学验证的对象，进一步，从各种生物学试验中筛选出斑马鱼模型，并发现其对特定指标的评价可以实现较为分明的风险等级的划分。并且，本发明对于整个美拉德反应产物对于有机体影响的评价方法具有便利的可验证性，例如，通过保质期内外的乳制品的检测，可以验证本发明的评价方法是合理且自洽的。

10、总之，本发明的目的在于提供一种评价美拉德反应产物对机体免疫系统损伤的方法，以斑马鱼作为模型生物，检测特定美拉德反应产物对免疫系统不同评价指标的损伤影响，并对相关结果进行统计分析和赋分，从而评价美拉德反应产物对机体免疫系统的损伤，为食品中美拉德反应的控制及食品质量控制提供支持。

11、用于解决问题的方案

12、为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

13、[1]、一种评价美拉德反应产物对机体免疫系统损伤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

14、(1)针对机体免疫系统设置评价指标；

15、(2)利用受试剂量的美拉德反应产物对斑马鱼进行暴露实验，测试斑马鱼的各评价指标；

16、(3)在统计学上分析受试组斑马鱼相比对照组斑马鱼的各评价指标的变化的显著性水平，就不同的显著性水平赋予分值，将各评价指标的分值加和得到总分，确定风险分级；

17、其中，所述免疫系统的评价指标包括中性粒细胞数量、巨噬细胞数量和t细胞数量中的至少一种；

18、所述美拉德反应产物包括2-糠醛、5-羟甲基糠醛、2-呋喃甲基酮和乙二醛中的至少一种。

19、[2]、根据[1]所述的方法，其特征在于，所述美拉德反应产物来源于乳制品。

20、[3]、根据[2]所述的方法，其特征在于，所述乳制品包括奶粉，所述奶粉包括婴幼儿配方奶粉、儿童配方奶粉、青少年配方奶粉、成人配方奶粉和中老年配方奶粉中的任意一种。

21、[4]、根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其特征在于，所述美拉德反应产物包括2-糠醛、5-羟甲基糠醛、2-呋喃甲基酮和乙二醛。

22、[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，

23、所述免疫系统的评价指标中的所述中性粒细胞数量为斑马鱼尾静脉中性粒细胞数量。

24、[6]、根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，

25、所述暴露实验的形式为将受试剂量的美拉德反应产物溶于溶剂配制为母液后水溶给予斑马鱼。

26、[7]、根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，

27、所述受试剂量以所述美拉德反应产物对斑马鱼的最大非致死浓度和/或10％死亡浓度为基准设置。

28、[8]、根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，

29、所述受试剂量包括所述美拉德反应产物对斑马鱼的1/9最大非致死浓度、1/3最大非致死浓度、最大非致死浓度和10％死亡浓度中的至少一种。

30、[9]、根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，

31、所述就不同的显著性水平赋予分值的方法为：

32、0.01≤p＜0.05，赋1分；

33、0.001≤p＜0.01，赋2分；

34、p＜0.001，赋3分。

35、[10]、根据[8]或[9]所述的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，

36、所述确定风险分级的方法为：

37、对于单一的美拉德反应产物：

38、1/9最大非致死浓度下，总分为0分表示安全，总分为1～5分表示低风险，总分为6～12分表示中风险，总分为13分以上表示高风险；

39、1/3最大非致死浓度下，总分为0～5分表示安全，总分为6～12分表示低风险，总分为13～19分表示中风险，总分为20分以上表示高风险；

40、最大非致死浓度下，总分为0～5分表示安全，总分为6～12分表示低风险，总分为13分以上表示中风险；

41、10％死亡浓度下，总分为0～5分表示安全，总分为6～19分表示低风险，总分为20分以上表示中风险；

42、对于多种美拉德反应产物的组合：

43、多种美拉德反应产物的1/9最大非致死浓度的组合下，总分为0～5分表示安全，总分为6～12分表示低风险，总分为13～19分表示中风险，总分为20分以上表示高风险；

44、多种美拉德反应产物的1/3最大非致死浓度的组合下，总分为0～5分表示安全，总分为6～12分表示低风险，总分为13以上表示中风险。

45、发明的效果

46、通过上述技术方案的实施，本发明取得了如下技术效果：

47、本发明针对机体免疫系统设置了评价指标，例如中性粒细胞数量、巨噬细胞数量和t细胞数量等，通过检测美拉德反应产物对模式生物斑马鱼各评价指标的影响并对相关检测结果进行统计学分析和量化赋分，可以实现针对单一或组合的美拉德反应产物对机体免疫系统损伤的评价，并可确定其具体的风险分级，也即本发明实现了针对美拉德反应产物对机体免疫系统造成的实际影响的安全性风险的系统性评估，可以为食品的实际生产和质量控制提供帮助。

48、并且，本发明提供的评价方法周期短、成本低、准确性高。