一种抗肾间质纤维化的三黄方及其代谢组学研究方法与流程

本发明属于中药检测，具体地说涉及一种三黄方活性成分及其代谢组学研究方法。

背景技术：

1、三黄方是黄芪、黄蜀葵花和大黄组成，临床实验结果表明具有很好的抗肾间质纤维化功效。目前关于三黄方的质量检测方法和其代谢组学方法未见报道。

2、代谢组学分析以生物样本为检测对象，以检测并筛选出重要生物学意义和显著统计学差异的代谢产物为主要目的，并在此基础上阐明生物体代谢过程和变化机制。通过筛选差异代谢物和代谢途径分析结果，对样本的代谢物进行相关功能预测和分析。

3、本发明基于代谢组学和lc-q-tof/ms筛选出三黄方的活性成分和筛选肾间质纤维化动物模型显著差异的代谢物，对探究三黄方的活性成分及其三黄方干预肾间质纤维化动物模型的潜在作用机制具有重要的意义，为临床肾间质纤维化患者的用药情况提供科学依据。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，开发一种关于三黄方的活性成分检测方法和代谢组学研究方法，通过本发明的方法可筛选出三黄方的活性成分和筛选三黄方干预肾间质纤维化动物模型前后显著差异的代谢物，对探究三黄方治疗肾间质纤维化的潜在作用机制和评估其安全性和有效性具有重要的意义。

2、技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种抗肾间质纤维化的中药组合物，它包括黄芪、黄蜀葵花和大黄。

4、作为优选方案，所述的一种抗肾间质纤维化的中药组合物，其特征在于，它由黄芪30～90份、黄蜀葵花30～90份、大黄10～30份组成。

5、一种新三黄方的活性成分检测方法，它包括以下步骤：

6、(1)新三黄方提取液的制备：

7、按重量比取黄芪、黄蜀葵花和大黄药材，加水煎煮提取，取煎煮液，过滤后收集煎煮提取液，合并煎煮提取液，浓缩，得到新三黄方提取液；

8、(2)混合标准品溶液的制备

9、分别称取没食子酸、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖、金丝桃苷、莨菪亭、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、大黄酸、黄芪甲苷、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚配制成单一的对照品溶液；

10、然后分别取上述没食子酸、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖、金丝桃苷、莨菪亭、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、大黄酸、黄芪甲苷、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚单一的对照品溶液，混合均匀，稀释得混合标准品溶液；

11、(3)新三黄方提取液成分分析

12、取步骤(1)新三黄方提取液，离心，取离心液注入液质联用仪lc-q-tof/ms分析。

13、一种新三黄方的代谢组学研究方法，它包括以下步骤：

14、(1)新三黄方提取液的制备：

15、按重量比取黄芪、黄蜀葵花和大黄，加水煎煮提取，取煎煮液，过滤后收集煎煮提取液，合并煎煮提取液，浓缩，得到新三黄方提取液；

16、(2)混合标准品溶液的制备

17、分别称取没食子酸、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖、金丝桃苷、莨菪亭、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、大黄酸、黄芪甲苷、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚配制成单一的对照品溶液；

18、然后分别取上述没食子酸、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖、金丝桃苷、莨菪亭、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、大黄酸、黄芪甲苷、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚单一的对照品溶液，混合均匀，稀释得混合标准品溶液；

19、(3)动物模型及血清制备：

20、取雄性sd大鼠，随机分为正常对照组及造模14天后肾间质纤维化动物模型组；正常及模型组大鼠均灌胃给以步骤(1)制备得到的新三黄方提取液，灌胃，大鼠眼眶取血；然后取血浆处理得血清样品溶液；

21、(4)新三黄方代谢成分分析

22、取步骤(2)混合标准品溶液和步骤(3)的血清样品注入液质联用仪lc-q-tof/ms分析；

23、(5)将lc-q-tof/ms采集的三黄方提取液和血浆样品的质谱数据进行处理，经过与对照品和数据库比较分析，对三黄方代谢产物进行鉴别和表征。

24、作为优选方案，以上所述的方法，步骤(1)为：按重量比3：3：1取黄芪、黄蜀葵花和大黄，加8～16倍体积比的水煎煮提取2次，每次提取30～120分钟，过滤后收集煎煮提取液，合并煎煮提取液，浓缩，得到新三黄方提取液。

25、作为优选方案，以上所述的方法，步骤(2)混合标准品溶液的制备方法为：

26、称取黄芪甲苷，用50％乙醇，含30％dmso稀释得浓度2mg/ml的黄芪甲苷储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

27、称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷，用50％乙醇稀释得浓度1mg/ml的毛蕊异黄酮葡萄糖苷储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

28、称取阿魏酸，用甲醇稀释得浓度为1mg/ml的阿魏酸储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

29、称取山奈酚，用甲醇稀释得浓度为1mg/ml的山奈酚储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

30、称取槲皮素，用甲醇稀释得浓度为2mg/ml的槲皮素储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

31、称取金丝桃，用50％甲醇稀释得浓度为1mg/ml的金丝桃苷储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

32、称取芦荟大黄素，用体积比1:1的乙醇和dmso稀释得浓度2mg/ml的芦荟大黄素储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

33、称取大黄酸，用体积比1:1的乙醇：dmso稀释得浓度为1mg/ml的大黄酸储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

34、取大黄素，用体积比1:1的乙醇：dmso稀释得浓度为1mg/ml的大黄素储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

35、称取大黄酚，用体积比为5:13的乙醇：dmso稀释得浓度为2.00mg/ml的大黄酚储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

36、称取大黄素甲醚，用体积比为5:13的乙醇和dmso混合液稀释得浓度为0.572mg/ml的大黄素甲醚储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

37、称取没食子酸，用50％甲醇稀释得浓度为1mg/ml的没食子酸储备液，用50％甲醇稀释100μg/ml的浓度备用；

38、称取表儿茶素，用甲醇稀释得浓度为1mg/ml的表儿茶素储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

39、称取莨菪亭，用50％乙醇稀释得浓度为1mg/ml的莨菪亭储备液，用50％甲醇稀释至100μg/ml的浓度备用；

40、混合标准品溶液的制备

41、分别取上述浓度均为100μg/ml的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、金丝桃苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、没食子酸、表儿茶素和莨菪亭单个标准品溶液混合均匀，用50％甲醇稀释得各化合物浓度均为2.00μg/ml的混合标准品溶液。

42、作为优选方案，以上所述的一种三黄方的代谢组学研究方法，步骤(3)动物模型及血清制备方法为：

43、取雄性sd大鼠，随机分为正常对照组及肾间质纤维化动物模型组；造模14天后，正常及模型组大鼠均灌胃给以步骤(1)制备得到的新三黄方提取液，7.25g/kg灌胃，大鼠眼眶取血，取血时间分别为给药后0h、0.5h、1h、2h和4h；

44、取200μl血浆，加入800μl甲醇，涡旋震荡1min，于12000rpm 4℃离心10min，取上清900μl，40℃吹干，残渣加入100μl 50％甲醇复溶，震荡1min，于12000rpm 4℃离心10min，取上清80μl，于12000rpm 4℃离心10min，得血清样品溶液。

45、作为优选方案，以上所述的方法，步骤4的lc-q-tof/ms分析的液相色谱条件为：

46、色谱柱：agilent sb c18，规格4.6mm×100mm，1.8μm；流动相：a相:0.1％甲酸水溶液，b相：体积比为1：1的甲醇和乙腈，柱温：40℃，梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

47、 时间min <![cdata[流速ml·min^-1]]> a％ b％ 0 0.40 85 15 2.5 0.40 80 20 7.0 0.40 75 25 12.0 0.40 50 50 19.0 0.40 10 90 21.0 0.40 10 90 28.0 0.55 40 60 31.0 0.55 85 15 35.0 0.40 85 15

48、。

49、所述的lc-q-tof/ms分析的质谱条件为：

50、q-tof/ms分析采用esi源正、负离子扫描模式，负离子源电压分别为-4500v，离子源温度为550℃，雾化气为n2，一级质谱扫描范围：m/z100～1000，dp：80v；gs1:50,gs2:60,cur:20,ce：10ev；采用ida模式采集二级质谱数据，采集范围：90～1000，dp:100v,ce：25ev；ces：15；正离子源电压分别为5500v，离子源温度为550℃，雾化气为n2，一级质谱扫描范围：m/z 100～1000，dp：100v；gs1:50,gs2:60,cur:20,ce：10ev；采用ida模式采集二级质谱数据，采集范围：90～1000，dp:100v,ce：30ev；

51、ces：15；ida设置响应信号强度>100cps的10个最高峰进行二级质谱扫描，开启动态背景扣除。

52、有益效果是：本发明通过大量实验筛选出具有抗肾间质纤维化的三黄方(黄芪、黄蜀葵花、大黄。并通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件进行lc-q-tof/ms分析三黄方的活性成分及其代谢产物，用化学组分析和代谢组分析相结合，能够相对全面、有效、可靠的揭示三黄方的活性成分和干预肾间质纤维化动物模型给药前后显著差异的代谢物，对探究三黄方治疗肾间质纤维化动物的潜在作用机制和评估其安全性和有效性具有重要的意义。