柚皮苷作为GIMAP7激动剂在RSV感染中的治疗方法

本发明涉及生物医药，具体为柚皮苷作为gimap7激动剂在rsv感染中的治疗方法。

背景技术：

1、rsv是一种普遍存在的病毒，也是造成免疫功能低下群体、老年群体、婴幼儿群体呼吸道感染的一大病毒病原体，每年带给全球巨大的疾病压力。研究表明几乎所有小孩在两岁前都会被rsv感染。但由于该病毒的感染具有自限性，因此大多数感染者没有任何症状，症状往往因年龄组和免疫状态而异，症状的表现范围从鼻炎到严重下呼吸道感染，包括细支气管炎和肺炎，导致住院和呼吸衰竭。其中毛细支气管炎是一种常见的下呼吸道感染，其特征是肺部小气道的炎症和阻塞。虽然有几种病毒引起细支气管炎，但rsv约占70％的病例。此外，因rsv感染而导致婴儿住院与慢性喘息和哮喘病以及学龄儿童呼吸功能下降有关。据科学家们估计，2015年全球有3310万例rsv急性下呼吸道感染，320万例住院，59,600例5岁以下儿童死亡。结合医院和社区死亡的数据估计，全球每年有94,600至149,400人死亡(绝大部分发生在发展中国家)。但遗憾的是迄今为止还没有获得许可的疫苗用于rsv的预防。也缺乏用于治疗rsv感染的药物，尽管利巴韦林已被批准用于治疗严重rsv感染，但由于其副作用和对职业暴露工人的致畸潜力，造成该药物的使用受到极大限制。因此阐明rsv与宿主细胞的相互作用模式对于疫苗和治疗药物开发尤为重要。我们以rsv为主题进行文献计量分析后使用bibliometrix对2000年至2023年的关键词进行趋势主题分析，发现细胞凋亡和自噬是当前研究rsv与宿主细胞相互作用的热点。这提示我们细胞自噬和凋亡在rsv感染过程中扮演着非常重要的作用。

2、gimap家族基因编码一种在进化上保守的gtp结合蛋白，该蛋白家族在脊椎动物和植物中均有表达。研究结果显示gimaps与bcl-2家族成员之间存在蛋白质相互作用，同样的gimap6与rab7类似通过与map1lc3b互作致map1lc3b脂化形式的积累继而导致自噬小体与溶酶体融合的发生，最近的研究证明gimap4，gimap5和gimap6被募集到弓形虫感染细胞的寄生虫液泡以促进液泡融合到溶酶体上以进行寄生虫破坏。这些提示了gimaps参与了细胞的自噬和凋亡的过程。我们的研究发现免疫相关蛋白gtpase7(gimap7)通过与lc3b的直接相互作用调控自噬向凋亡转化而发挥抗rsv的作用，且激活gimap7的表达有效抑制rsv感染的小鼠模型肺部组中rsv病毒复制，并缓解肺部病理状态，因此gimap7是针对rsv的有效治疗靶点。

3、呼吸道合胞病毒(rsv)是一种有包膜的负义单链rna，属于正肺病毒属，该病毒直径约100-300nm,基因组包含10个基因，编码了11种蛋白质，该病毒是免疫功能低下群体、老年群体、婴幼儿群体呼吸道感染的重要病原体，每年造成几百万儿童住院，是健康的巨大威胁。但是迄今为止还没有获得许可的疫苗或治疗药物，因此迫切需要开发新的有效的抗rsv治疗药物或疫苗，为此本发明提出柚皮苷作为gimap7激动剂在rsv感染中的治疗方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于通过虚拟筛选和体内、体外实验验证了柚皮苷是gimap7的中草药来源的小分子激动剂，并且在体内和体外能够有效的发挥抗rsv感染效果。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：柚皮苷作为gimap7激动剂在rsv感染中的治疗方法，其方法包括以下步骤：

3、s1：虚拟筛选与分子对接

4、gimap7晶体结构下载自rcsb pdb数据库，然后通过autodock vina tool以及pymol工具进行gimap7晶体结构检查，利用targetmol公司提供的天然产物库作为筛选与gimap7蛋白结合的来源，该公司提供的天然产物库包含适合高通量筛选的生物活性天然产物单体有4320种，使用的软件包括autodocktools1.5.6，open babel 3.1.1，以及可视化软件pymol。autodocktools1.5.6和pymol软件用于除水与加氢蛋白受体和小分子配体准备操作，高通量分子对接由autodock vina进行，我们通过计算机对小分子数据库进行两步筛选。

5、2)分子动力学模拟

6、分析配合物相互作用的结构稳定性对了解其结合亲和力至关重要，在本发明中，我们在linux centos7操作系统上使用gromacs2019.6软件进行分子动力学模拟，所有数据由originlab处理；

7、s2：细胞培养与rsv感染

8、人正常肺上皮细胞系beas-2b、pc9和hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留，rsv(long strain/a2 type)was stored by the department of medicalmicrobiology of central south university，在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清的dmem和1640培养基(37℃培养箱，5％co2)中培养；

9、s3：western blot检测小分子化合物对gimap7表达的影响

10、取细胞生长状态良好的beas-2b细胞铺于六孔板中；

11、s4：cck8检测化合物对beas-2b和pc9细胞毒性

12、细胞毒性试验采用cell counting kit-8检测，beas-2b在96孔细胞培养板的密度2×103个细胞，加入不同浓度的柚皮苷(0mm、0.5mm、1mm、2mm、3mm和5mm)；

13、s5：rt-qpcr检测rsv,igf1r的表达以及rsv病毒dna载量

14、建立小分子化合物细胞组和dmso对照组，从hela的beas-2b细胞中制备总rna，并用smartspectmplus分光光度计(bio-rad,usa)进行定量，使用trizol试剂从肺组织中提取总rna，使用rr036a primescript rt master mix将每个样本逆转录为cdna，按照说明书使用2×sybr green qpcr master mix进行扩增；

15、s6：间接免疫荧光检测rsv的荧光信号

16、4％多聚甲醛固定和0.4％ triton-x100通透beas-2b细胞，肺组织切片在95％乙醇和0.1％triton-x100中通透，用正常山羊血清封闭20分钟，加入rsv主要表面糖蛋白g单克隆抗体兔一抗4℃孵育过夜，第二天，用pbst洗切片3次，每次4min，滴加稀释的山羊抗兔igg/cy3二抗，37℃孵育1h，再pbst浸洗3次，每次4min，滴加dapi后避光孵育5min(复染核)，最后pbst清洗切片5次，每次4min后封片在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察拍照；

17、s7：动物模型

18、准备24只4-6周龄、雌性、balb/c小鼠，经随机方式归入至健康对照组、rsv感染组、gimap7筛选药物干预组：柚皮苷(10mg/kg)、柚皮苷(40mg/kg)，各组实验动物皆先于标准条件下适应5-7d；异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种rsv 5×106pfu(100μl)；

19、s8：he染色

20、每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片，按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化；

21、s9：酶联免疫吸附试验(elisa)

22、收集小鼠肺匀浆，使用elisa试剂盒测定il-1β、il-6和tnf-α水平，小鼠肺匀浆4℃1000rpm离心10min，收集上清液，使用tecan f50在450nm处测量od值；

23、s10：统计学分析

24、借助excel，开展原始计数资料的整合与分析工作，graphpad 8.0被用于作图和分析，使用wilcoxon秩和检验或student's t检验比较组间差异，所有实验重复三次以上，当p值在0.05以下时判定差异显著，具统计学价值。

25、优选的，所述s1中第一次进行刚性对接，选择对接分数<-7kj/mol的小分子药物进行。

26、优选的，所述s1中第二次使用autodock vina进行柔性对接，然后选取top6药物进行分子动力学模拟和生物活性测试。

27、优选的，所述s2中待细胞密度达85％左右，加入不同浓度的化合物柚皮苷并以1×104pfu的rsv感染细胞，待24h后检测rsv的病毒载量。

28、优选的，所述s3中待细胞贴壁后，加入不同浓度的小分子化合物柚皮苷(0mm、0.5mm、1mm和2mm),分别作用24h后，提取细胞rna和细胞蛋白进行进一步实验。

29、优选的，所述s4中按照cck-8试剂盒方案处理细胞，使用tecan f50测定每个孔在450nm处的分光光度吸收值。

30、优选的，所述s5中采用cfx96 touchtm深井实时荧光定量pcr检测系统，在热循环条件下使用tbex taq进行定量pcr。

31、优选的，所述s6中用pbst洗五次，每次4分钟，然后dapi染色5分钟，在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察。

32、优选的，所述s7中对于模拟感染(对照组)，小鼠给予等量的无菌pbs。在rsv感染后2～4h腹腔注射小分子化合物柚皮苷。

33、优选的，所述s10中*、**、***依次代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

35、本发明的免疫相关蛋白gtpase 7(gimap7)通过与lc3b的直接相互作用调控自噬向凋亡转化而发挥抗rsv的作用。且激活gimap7的表达有效抑制rsv感染的小鼠模型肺部组中rsv病毒复制，并缓解肺部病理状态。因此gimap7是针对rsv的有效治疗靶点，在本发明中我们通过虚拟筛选和体内外实验验证了gimap7的小分子激动剂柚皮苷抗rsv效果，为探索有效的抗rsv感染的治疗药物提供了实验依据。