一种核酸适配体负载钌(II)配合物纳米网及其制备方法和应用

本发明属于核酸适配体，特别涉及一种核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网及其制备方法和应用。

背景技术：

1、癌症的早期诊断可以促进及时的医疗干预和有效的治疗，从而抑制肿瘤的生长和发展，准确的诊断和治疗已成为缓解肿瘤发展、提高患者生存率的有效手段。分子成像可以无创地显示与癌症不同阶段相关的关键分子靶点和宿主反应，从而促进癌症的精确诊断和治疗，如荧光生物成像，这种方法是一种很有前途的非侵入性、实时性和高分辨率成像方法，可用于肿瘤的早期诊断。

2、荧光生物成像主要依赖小分子探针，小分子探针主要由三部分组成，一个是与蛋白质特异性作用的反应基团，一个调控反应基团活性和特异性的链接子，一部分用来富集、纯化和探测靶标分子的报告基团通常也称标签(tag)，报告基团(tag)的作用是方便人们简单快速的识别或纯化被标记的蛋白。将报告基团引入到活性小分子上是化学蛋白质组学利用小分子探针发现药物靶标中关键的一步。最常用的报告基团有荧光基团及生物素等。

3、实际应用中，荧光分子探针的形态常见为颗粒状或纤维状，这与分子结构、合成方法和应用需求有关。本发明根据预期应用和目标分子特点，通过调整配体结构，从而设计出具有网状结构的荧光探针，实现对肿瘤细胞的靶向识别，并克服配体难以被肿瘤细胞吸收，以及对肿瘤细胞毒性较大的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网及其制备方法和应用。本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网能够实现对肿瘤细胞的靶向识别。

2、本发明提供一种核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网，包括核酸适配体和与所述核酸适配体化学结合的钌(ii)配合物，所述核酸适配体与所述钌(ii)配合物组装形成纳米网状结构；

3、所述钌(ii)配合物包括中心金属离子钌(ii)、主配体和辅助配体；

4、所述主配体包括1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉，所述辅助配体包括2,2-联吡啶或1,10-菲啰啉。

5、优选地，所述的核酸适配体为as1411。

6、优选地，所述化学结合为配位键结合和/或共价键结合。

7、优选地，当所述辅助配体为2,2-联吡啶时，所述1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉替换为1-4’-丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉偶联毛兰素，或1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉和1-4’-丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉偶联毛兰素的混合物。

8、优选地，所述钌(ii)配合物与核酸适配体的摩尔比为0.5～1:1。

9、优选地，所述纳米网状结构中形成网的纤维状直径为0.10～35.4nm；

10、所述纳米网状结构中网孔的尺寸为0.5～30nm。

11、优选地，所述纳米网状结构的高度优选为0.5～30nm。

12、本发明还提供了上述技术方案所述核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网的制备方法，包括以下制备步骤：

13、将钌(ii)配合物和核酸适配体混合，进行孵育，得到所述核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网。

14、优选地，所述孵育的温度为30～50℃；所述孵育的时间为12～48h。

15、本发明还提供了上述技术方案所述核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网或所述制备方法制备得到的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网在制备肿瘤靶向荧光探针中的应用。

16、本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网，包括核酸适配体和与所述核酸适配体化学结合的钌(ii)配合物，所述核酸适配体与所述钌(ii)配合物组装形成纳米网状结构；所述钌(ii)配合物包括中心金属离子钌(ii)、主配体和辅助配体；所述主配体包括1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉，所述辅助配体包括2,2-联吡啶或1,10-菲啰啉。

17、本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网具有纳米网状结构，该网状结构具有很高的比表面积，使得核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网与肿瘤细胞膜和细胞核的结合能力更强；此外，该网状结构具有很好的稳定性，能够抵抗细胞液和生物酶的侵蚀，制备成荧光探针后，提高了荧光探针的生物相容性和灵敏度，实现对肿瘤细胞的靶向识别，且能够降低细胞毒性。钌(ii)配合物中的中心金属离子和配体能够与核酸适配体上的碱基相互作用，形成共价键或配位键多种键合作用，形成多种g-四链体构象，这些构象能够自发折叠，从而形成纳米网状结构。本发明采用钌(ii)配合物，作为荧光探针的发色基团，具有特征的荧光发射峰，本发明在钌(ii)配合物上引入烷烃链和苯乙烯基团，能够提高钌(ii)配合物进入癌细胞的跨膜吸收能力。本发明采用核酸适配体，作为肿瘤细胞的靶向识别基团，能够形成g4 dna构象，进而与钌(ii)配合物结合，实现对肿瘤细胞的靶向性识别。在本发明中，核酸适配体与钌(ii)配合物结合后形成的纳米网状结构更稳定，既克服了核酸适配体代谢不稳定，容易被核酸酶清除的缺陷，又提高了核酸适配体负载钌(ii)配合物的生物活性，实现对肿瘤细胞的靶向性识别。

18、本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网的主配体为1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉时，带有溴丁基基团的钌(ii)配合物既有亲水性又有亲脂性，能够与核酸适配体中的碱基对结合，有利于网状结构的形成。本发明还发现辅助配体为2,2-联吡啶，更容易形成网状结构，并且联吡啶修饰的的钌(ii)配合物与核酸适配体结合形成的网状结构更清晰完整，原因是联吡啶具有良好的平面性，容易与核酸适配体中碱基对之间发生有效的π-π堆积作用，更有利于促进网状结构的形成(如实施例2的图5)。在本发明中，当钌(ii)配合物接枝毛兰素分子后，可以增强钌(ii)配合物的荧光强度，并降低钌(ii)配合物的细胞毒性，更有利于肿瘤细胞的靶向识别；由于毛兰素体积位阻和空间位阻的增加，在一定程度上会阻碍网状结构的形成，但是从原子力显微镜(afm)图中仍可以看出毛兰素修饰的联吡啶钌(ii)配合物与核酸适配体之间有联结(如实施例3的图9)，可以用于制备荧光探针，用于肿瘤细胞的靶向识别检测。在本发明中，当辅助配体为具有较高立体性的1,10-菲罗啉时，与主配体1-4’-溴丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉结合后形成的钌(ii)配合物与核酸适配体还有结合(如实施例5图17)，也可以用于制备荧光探针。但是当主配体替换成1-4’-丁基-2-苯乙烯基咪唑[4,5f][1,10]菲啰啉偶联毛兰素后，由于菲罗啉的空间位阻较大，接枝上毛兰素分子后空间位阻和体积位阻效应累加，导致钌(ii)配合物与核酸适配体的结合亲和力和选择性降低，无法插入核酸适配体的碱基对之间，基本无法形成网络结构(如对比例1图21)，无法用于制备荧光探针。

19、本发明通过荧光共振能量转移实验(fret)、熔点实验和荧光滴定实验证明本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网结构稳定，并通过cd光谱和原子力显微镜测试证明钌(ii)配合物与核酸适配体结合后的荧光强度增加了近3倍，大幅提高了对肿瘤细胞的靶向识别性。本发明提供的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网在抗肿瘤前期诊断和治疗方面应用的潜力巨大，具有重要的临床应用价值。

20、本发明还提供了所述核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网的制备方法，包括以下制备步骤：将钌(ii)配合物和核酸适配体混合，进行孵育，得到所述核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网。该制备方法将核酸适配体和钌(ii)配合物孵育结合，得到的核酸适配体负载钌(ii)配合物纳米网能够有效降低钌(ii)配合物的细胞毒性，提高对肿瘤细胞的靶向识别能力。而且本发明提供的制备方法操作简单，收率高，具有潜在市场化应用前景。