一种GSH响应型细胞膜仿生纳米药物、制备方法及应用

本发明涉及生物医药制剂，具体为一种gsh响应型细胞膜仿生纳米药物、制备方法及应用。

背景技术：

1、化疗是治疗恶性肿瘤最常用手段之一，但肿瘤细胞耐药是导致肿瘤常规化疗失败的主要因素，其发生与多种机制有关，包括细胞膜对药物的摄取减少和外排增多、药物亚细胞分布的改变使药物无法接近其作用靶点、肺耐药性相关蛋白及乳腺癌耐药性蛋白对化疗药物的胞吐作用、细胞解毒系统和修复系统功能的加强使药物迅速灭活并及时修复药物引起的肿瘤细胞dna损伤、药物靶点在质和量上的改变等。发生上皮间质转化(epithelial tomesench ymal transition，emt)的肿瘤细胞可获得凋亡抵抗，从而导致肿瘤对放、化疗的耐受，而对化疗耐药的乳腺癌细胞亦具有emt的特征。emt与肿瘤化疗耐药密切相关，并且转变后的间质表型的肿瘤细胞相较于上皮表型的肿瘤细胞更易具有耐药性，维持上皮表型的重要黏附分子被间质表型分子所取代，从而导致细胞间黏附性降低、细胞迁移、侵袭能力增强，上述两种蛋白与肿瘤的耐药性也具有密切关系，且emt诱导药物不仅可增加肿瘤细胞的侵袭性，还可通过上调abc转运蛋白的表达而增加化疗药物的外排，从而导致耐药的发生。

2、近年来研究发现emt在诱导肿瘤细胞耐药形成中起重要作用。肿瘤em t发生受复杂信号通路的调控，这些信号通路也在诱导肿瘤细胞耐药中起重要作用。相关研究发现肿瘤emt状态下处于高度甲基化的状态，stm2457作为mettl3的一种小分子抑制剂能够有效的降低其甲基化水平，细胞膜仿生纳米药物能够有效的将药物递送到肿瘤部位当中，因此通过降低肿瘤m6a甲基化的水平，从而逆转emt的状态，克服肿瘤的耐药性亦成为潜在的肿瘤治疗策略。同时肿瘤微环境是一个复杂的动态平衡体系，主要表现为：gsh高表达和低ph值，该环境适宜于肿瘤细胞的生长。因此如何打破这种适宜环境，精确调控或利用肿瘤微环境(tme)中的独特物质是抗肿瘤研究的关键，也是提高肿瘤治疗的有效策略。

3、目前基于细胞膜纳米材料的药物传递系统主要采用两种策略：一种方法是封装(超分子)或者非共价化学，即药物分子通过非共价键作用封装在细胞膜纳米载体内，这种方法的优点是药物在释放前后没有进行化学改性，缺点是细胞膜衍生的脂质囊泡主要是利用其双层膜的疏水结构进行疏水性药物的包覆负载，然而，有限的双分子空间结构常常致使其对药物的载量相对较低；此外，脂质固有的流动性特质也常导致药物分子随着时间的推移出现大量泄露，成为限制这类载药系统进一步发展应用的关键因素之一；另一种方法是基于药物在纳米载体内以共价键连接形成前药，这种方法确保了纳米载体的高稳定性，缺点是可能伴有药物负效率、共价键未完全裂解导致药物的药效降低。因此，一个理想的细胞膜仿生纳米药物除了具有一定的稳定性，同时也需要具备在特定的环境下能够有效地将药物释放，从而发挥药物的功效。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种gsh响应型细胞膜仿生纳米药物、制备方法及应用，本发明的gsh响应型细胞膜仿生纳米药物是通过细胞膜囊泡上的叠氮化基团利用点击化学反应原理键接上-sh基团，利用交联剂，使得小分子抑制剂与-sh基团之间形成结构更稳定的二硫键，小分子抑制剂的载药率相对更高，且随着时间的推移药物泄露相对较少，稳定性强；在其具有良好的生物相容性同时，还具有较长的血液循环时间；另外，当gsh响应型细胞膜仿生纳米药物富集至肿瘤病灶区时，肿瘤部分富含的gsh能够有效地打开细胞膜仿生纳米药物的二硫键，从而将小分子抑制剂释放出来，释放的小分子抑制剂能够有效地降低肿瘤的甲基化水平，从而逆转肿瘤emt的状态，克服肿瘤的耐药性，可有效减少化疗药物的使用，从而解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种gsh响应型细胞膜仿生纳米药物，包括作为载体的细胞膜囊泡，所述的细胞膜囊泡由膜表面过表达叠氮化合物的免疫细胞经过细胞膜提取、膜挤压制备而成，细胞膜囊泡上的叠氮化合物与生物偶联化合物通过点击化学反应键合形成-sh基团，-sh基团通过交联剂连接小分子抑制剂。

4、作为本发明的进一步方案，所述免疫细胞为巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞中的一种或多种。

5、作为本发明的进一步方案，所述小分子抑制剂具体为mettl3甲基化抑制剂中的一种或多种。

6、作为本发明的进一步方案，所述叠氮化合物具体为n-叠氮乙酰基氨基半乳糖-四酰化。

7、作为本发明的进一步方案，所述生物偶联化合物具体为二苯基环辛炔-巯基；

8、所述交联剂具体为琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯。

9、一种gsh响应型细胞膜仿生纳米药物制备方法，包括如下步骤：

10、s1、选取至少一种免疫细胞，与叠氮化合物共孵育，得到修饰有叠氮基团的免疫细胞，即为功能化免疫细胞；

11、s2、对功能化免疫细胞进行细胞膜提取，得到对应的功能化免疫细胞膜碎片；

12、s3、通过脂质体挤压器对功能化免疫细胞膜碎片进行挤压，得到对应的功能化细胞膜囊泡；

13、s4、叠氮基团与生物偶联化合物通过点击化学反应键合形成-sh基团，通过交联剂将-sh基团与小分子抑制剂以二硫键的方式结合在一起，即可得到gsh响应型细胞膜仿生纳米药物。

14、作为本发明的进一步方案，所述步骤s1中功能化免疫细胞的制备方法具体为：将选取的至少一种免疫细胞接种于dmem培养基中，于37℃培养箱中培养，直至细胞汇合度达到75-85％时，向dmem培养基中加入叠氮化合物，孵育48h；最后，以1500-2500rpm于4℃下离心5-15min，即为功能化免疫细胞，收集功能化免疫细胞，并用pbs缓冲液清洗多次，备用。

15、作为本发明的进一步方案，所述步骤s2中细胞膜提取的方法具体为：

16、将收集到的功能化免疫细胞悬浮于细胞裂解缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂，随后，用1ml的注射器对置于冰上的细胞悬液进行抽提，使得细胞膜裂解缓冲液与功能化免疫细胞充分混匀，每隔5min抽提一次，重复抽提步骤5-6次，置于-80℃冰箱冷冻30min，取出解冻，冷冻-解冻循环4次后，使用离心机进行差速离心处理，得到对应的功能化免疫细胞膜碎片，保存在-80℃待用；

17、差速离心处理的过程为：首先以700g的转速，离心10min，得到上清液，再以14000g的转速，离心30min，得到下层细胞膜沉淀。

18、作为本发明的进一步方案，所述步骤s3中功能化细胞膜囊泡提取的具体步骤为：

19、将纯化的功能化免疫细胞膜碎片悬浮于缓冲液当中，在冰浴中使用超声波发生器对悬浮后的功能化免疫细胞膜碎片进行超声波处理，超声波发生器功率为10w，处理时间为10min，然后，使用脂质体挤出器，通过聚碳酸酯多孔膜进行挤出，从而获得功能化细胞膜囊泡；其中，聚碳酸酯多孔膜孔径梯度为1μm、800nm、400nm和200nm。

20、作为本发明的进一步方案，所述步骤s4的具体步骤为：

21、首先将交联剂和生物偶联化合物在室温下溶解于有机溶剂中，向功能化细胞膜囊泡分散液当中加入生物偶联化合物和交联剂，搅拌混匀，反应12h；反应结束后，将产物转移至透析袋中，在含有tween 80的去离子水中，透析30-50h，以除去未反应的生物偶联化合物和交联剂；然后向其中加入小分子抑制剂，反应12-15h，反应结束后，将产物转移至透析袋中，在含有tween 80的去离子水中，透析30-50h，以除去未反应的小分子抑制剂，冷冻干燥，即获得gsh响应型细胞膜仿生纳米药物粉末，-80℃储存待用；

22、其中，有机溶剂为二甲基亚砜，生物偶联化合物、交联剂和小分子抑制剂的投料质量比为1：2：2，tween 80的质量分数为1/1000。

23、gsh响应型细胞膜仿生纳米药物联和化疗药物紫杉醇的应用。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

25、1、本发明gsh响应型细胞膜仿生纳米药物的过程是：首先，采用糖代谢技术将叠氮基团嵌入至免疫细胞膜上，然后，制备功能化细胞膜囊泡，修饰有叠氮基团的功能化细胞膜囊泡通过与生物偶联化合物之间的点击化学反应形成装载在细胞膜囊泡表面的-sh基团，通过交联剂使得小分子抑制剂与-sh基团之间形成结构稳定的二硫键，小分子抑制剂的载药率相对更高，稳定性更好，随着时间的推移，药物泄露相对较少；

26、2、本发明gsh响应型细胞膜仿生纳米药物富集至肿瘤病灶区，在肿瘤部位微环境的作用下，二硫键会被打开，从而高效释放出小分子抑制剂，保证了良好的药效；释放出的小分子抑制剂可有效降低肿瘤细胞的甲基化水平，逆转肿瘤emt的状态，从而克服肿瘤的耐药性，有利于协同化疗药物抑制肿瘤生长；

27、3、本发明采用细胞代谢工程制备功能化免疫细胞膜，采用功能化生物正交反应在细胞膜囊泡表面键结化学基团，制备方法简便；且制备的gsh响应型细胞膜仿生纳米药物具有生物相容性好、癌细胞摄取效率高以及载体毒性低等优点，是一种有较高生产性价比、高效、低毒的药物制剂。

28、综上所述，本发明的药物通过二硫键连接小分子抑制剂，不仅载药率相对更高，且稳定性更好，在血液循环过程中药物泄露相对较少；在肿瘤部位微环境下小分子抑制剂才会被完全释放，从而降低肿瘤emt的甲基化水平，克服肿瘤耐药性，协同化疗药物治疗肿瘤显示出更多效的生物学效应，为癌症的治疗提供广阔的应用前景。