一种脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒的制备方法及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒的制备方法及其应用。

背景技术：

1、癌症是全球死亡的主要原因，也是最普遍的疾病，始终影响着人类健康生活以及社会经济的安定发展。目前据世界卫生组织（who）统计，2022年有近2000万新发癌症病例和近1000万癌症死亡病例。并且基于人口统计学的预测表明，到2050年，每年的癌症新病例数将达到3500万，比2022年的水平增加77%。所以说，针对癌症的控制措施愈发的必要。

2、目前的肿瘤治疗方法有手术治疗、放化疗、靶向治疗、骨髓移植治疗、免疫治疗等。其中靶向治疗是通过在细胞分子水平上针对明确的致癌位点特异性结合，破坏其原有生物作用，促使细胞发生特异性死亡的方法。新型的靶向治疗新策略-蛋白降解靶向嵌合体（protac），由于其在治疗性调节蛋白方面的潜力而引起了人们极大的兴趣。蛋白降解靶向嵌合体是由两个配体连接组成的异双功能小分子：一个配体靶向目标蛋白质，而另一个配体招募e3泛素连接酶。当蛋白降解靶向嵌合体同时结合目标蛋白和e3连接酶后，可诱导目标蛋白的泛素化，随后被泛素-蛋白酶体系统（ups）降解。相对于小分子抑制剂，蛋白降解靶向嵌合体具有高选择性、可克服耐药性、靶向不可成药等优势。但由于其分子量大，存在水溶性差、细胞渗透性低等问题，限制了蛋白降解靶向嵌合体在生物体内的应用。虽然蛋白降解靶向嵌合体的发展已经得到了巨大的进步，但是依然存在着蛋白降解靶向嵌合体单一疗法效果差，临床转化差等问题。与目前传统的肿瘤放化疗相比，蛋白降解靶向嵌合体的适用度还远远不足，需要更多蛋白降解平台被开发出来。

3、纳米递送体系，由于纳米粒子尺寸小以及能有效进入病变区域的优势，在癌症治疗领域有着广泛的应用。纳米递送体系可通过增强药物稳定性、减少不良反应和调节药代动力学特征等方面来提高疗效和降低生物毒性。因此，基于纳米递送的给药方式可克服传统疗法面临的许多障碍，并正在成为诊断和治疗策略的新途径。

技术实现思路

1、为解决蛋白降解靶向嵌合体脱靶性高、钩效应限制以及药代动力学差等问题，本发明提供了一种脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒的制备方法及其应用。本发明通过克服蛋白降解靶向嵌合体在肿瘤细胞中的脱靶性、钩效应以及实现蛋白降解靶向嵌合体在生物体内的长循环，从而大幅度增加蛋白降解靶向嵌合体的体内利用率，发挥良好的抗肿瘤作用。

2、本发明脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

3、步骤1：将羧酸化靶向小分子与聚二甲双胍混合溶解于有机溶剂中，在一定的温度及催化剂条件下反应，得到靶向小分子与聚二甲双胍连接物1；将羧酸化募集小分子与聚二甲双胍混合溶解于有机溶剂中，在一定温度及催化剂条件下反应，得到募集小分子与聚二甲双胍连接物2；将所述连接物1、2共混得到聚蛋白降解靶向嵌合体正电性混合溶液。靶向小分子、募集小分子与聚二甲双胍一般是通过化学键进行连接。

4、步骤2：将所述聚蛋白降解靶向嵌合体正电性混合溶液与透明质酸溶液共混，得到负电性聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒。其中，所述负电性聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒由连接物1、2与透明质酸静电吸附而成。

5、步骤3：将所述负电性聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒与脂质体囊泡混合，通过配备有纳米级聚碳酸酯膜的微型挤出器反复挤压，获得脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒。

6、进一步，步骤1中，将羧酸化靶向小分子与聚二甲双胍以质量比4~0.5:2~0.5混合溶解于dmso中，在0~60℃及催化剂存在的条件下反应12~48h，得到靶向小分子与聚二甲双胍连接物1；将羧酸化募集小分子与聚二甲双胍以质量比3~0.5:2~0.5混合溶解于dmso中，在0~60℃及催化剂存在的条件下反应12~48h，得到募集小分子与聚二甲双胍连接物2；在10℃~40℃条件下，将连接物1、2分别溶于去离子水，共混后超声1~20分钟，得到聚蛋白降解靶向嵌合体正电性混合溶液。

7、所述催化剂为缩合剂，选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n'-二环己基碳二亚胺中的一种或几种。

8、所述靶向小分子选自mk1775、4-羟基他莫昔芬、帕博西尼、jq1、达沙替尼、吉非替尼、恩杂鲁胺、nlg919、吲哚美辛、奥拉帕尼、rsl3中的一种或几种。

9、所述募集小分子选自泊马度胺、来那度胺、沙利度胺、vh032、vh298中的一种或几种。

10、所述靶向小分子与聚二甲双胍连接物1的载药率为5%~95%。

11、所述募集小分子与聚二甲双胍连接物2的载药率为5%~95%。

12、所述载药率计算公式：。

13、进一步，步骤2中：在10℃~40℃条件下，将所述聚蛋白降解靶向嵌合体正电性混合溶液快速加入到透明质酸溶液中，超声1~20分钟，混合均匀后得到负电性聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒。聚蛋白降解靶向嵌合体与透明质酸的共混质量比一般为0.5:0.1~10之间。

14、进一步，步骤3中，包括如下步骤：

15、3a、将1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（dopc）、（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基铵-氯盐（dotap）、n-（羰基－甲氧基聚乙二醇2000）-1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺（dspe-mpeg2000）按摩尔比1~12:0.5~6:0.5~10的比例溶解在氯仿中，反应体系均匀后用旋转蒸发仪干燥有机溶剂，得到干燥的脂质膜，再将脂质膜在去离子水溶液中超声水化得到脂质悬浮液，通过配备有纳米级聚碳酸酯膜的微型挤出器反复挤压得到脂质体囊泡。

16、3b、将溶于去离子水的负电性聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒和脂质体囊泡混合，超声1~20分钟，混合均匀，通过配备有纳米级聚碳酸酯膜的微型挤出器反复挤压，获得脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒。

17、聚蛋白降解靶向嵌合体纳米颗粒与脂质体囊泡共混质量比一般为0.2~1:0.5~5之间。

18、所述聚碳酸酯膜采用avanti polar lipids厂家生产的脂质体挤出器配套的聚碳酸酯膜，所用尺寸规格范围为100nm~1000nm。

19、本发明脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

20、本发明的有益效果体现在：

21、本发明设计了一种脂质体囊泡包裹的靶向蛋白降解纳米颗粒，其中，基于聚二甲双胍的聚蛋白降解靶向嵌合体提供了有效的多配体靶向和多位点募集的功能，在肿瘤细胞中可靶向多个目标蛋白，并通过募集多个e3泛素连接酶进行蛋白泛素化，最后由泛素-蛋白酶体系统识别并降解。通过脂质体囊泡的包裹，聚合蛋白降解靶向嵌合体可避免在血液循环中的不稳定扩散，促使其更好的滞留在肿瘤部位并被肿瘤细胞内吞。与基于小分子的蛋白降解靶向嵌合体相比，聚蛋白降解靶向嵌合体可具有高效的蛋白降解效果、血液循环时间长以及靶向肿瘤积累等优势，聚蛋白降解靶向嵌合体为精确构建蛋白降解靶向嵌合体提供了一个通用的平台，并为蛋白降解靶向嵌合体的未来临床转化应用提供了一种有前途的模式。