一种具有抗衰老功效的红茶发酵液的制备方法及应用与流程

本发明涉及茶发酵领域，尤其涉及一种具有抗衰老功效的红茶发酵液的制备方法及应用。

背景技术：

1、红茶是以适宜的茶树新芽叶为原料，经萎凋、揉捻、发酵、干燥等一系列工艺过程精制而成的茶，属全发酵茶。红茶的“发酵”，在中国茶叶的惯用语境中，实际与微生物发酵全然不同，实际上是一系列生物酶促反应。即经过“揉捻”使植物细胞壁破损后，原存在于细胞壁中的多酚氧化酶（ppo）和过氧化物酶（pod）被释放，在“发酵”期间，酶促氧化将细胞液中茶多酚类物质氧化成茶黄素、茶红素和茶褐素，最后经过“高温烘焙”，高温使酶失活防止过度发酵，并且迅速蒸发水分。

2、茶黄素（tfs）是红茶的重要品质成分之一，被称为茶叶中的软黄金。茶黄素是一类具有苯骈卓酚酮结构的混合物，主要由儿茶素类和没食子儿茶素类配对氧化缩聚合成。近年来的研究表明，茶黄素具有类似茶多酚的功能，甚至在抗脂质过氧化和抗dna损伤、降血脂、抗癌等方面药效比茶多酚还要强。茶红素（trs）是一类复杂的不均一性酚性化合物的总称，其相对分子量大小主要在700~40000 da之间，主要由儿茶素、茶黄素等氧化聚合、缩合而成，占红茶干物总量的9-19%，约占红茶中多酚类物质的75%左右。根据现代药理研究表明，茶红素通过调节生物体内各种酶系活性，也表现出较强的抗氧化性能；且茶红素可以激活一些清除毒素的蛋白质，控制一些特异酶制造，改善机体的免疫功能，因此，茶红素相较儿茶素还具有较优的抗突变作用、防肿瘤防癌作用。茶褐素（theabrownin，tb）由茶黄素和茶红素等多酚类物质进一步氧化衍生而成，天然存在于红茶、绿茶和黑茶中。茶褐素对改善人体的综合代谢平衡大有裨益，具有降血糖、血脂、血压、尿酸等效果，同时也是一种很有前途的抗癌候选物质。专利cn111840412a说明了茶褐素作为天然物质在抑制黑色素瘤药物中的应用。专利cn114145368a公开了一种红茶叶提取物及其制备方法，通过利用特殊比例的硬水热水提取高含量茶褐素的红茶叶提取物，虽然茶褐素抗氧化效果低于茶多酚中的主要成分egcg，在abts试验中，茶褐素的ic50值为13.21 ppm，egcg的ic50值为1.57 ppm；但茶褐素具有更加优异的恢复线粒体膜电位和抗uvb光老化抗衰功效。

3、而茶多酚是茶叶中的主要成分之一，是一类具有苦涩味的天然多酚类化合物，具有超强的抗氧化和清除细胞内活性氧功效功能。到目前为止，针对红茶发酵液的制备工艺专利有很多，利用微生物代谢的丰富酶及代谢产物有助于提取红茶中氨基酸、茶多酚、茶黄素等活性成分，且发酵液中富含益生菌菌株，比如乳酸菌、乳杆菌、酵母菌等，且代谢产品可以有助于皮肤抗衰老、美白等功效。例如，专利cn115105452a将红茶发酵液利用酿酒酵母菌或克鲁斯假丝酵母或酒香酵母中任一种或至少两种组合进行第一次发酵，利用乳酸菌、乳杆菌和醋酸菌进行第二次发酵，实现多种益生菌与红茶发酵液的多重发酵，使红茶发酵滤液中富含更多的益生菌代谢成分，具有护肤功效。但该专利提供的红茶发酵滤液中茶多酚含量仅为13.5 g/l。茶多酚含量不高的原因可能是其先将红茶进行提取再发酵的工程中：一是常规高温提取方式可能使红茶中茶多酚提取率不高且易变性氧化，二是多菌种发酵产生的活性物使茶多酚被氧化形成茶红素、茶褐素等成分，该专利未深入考虑发酵过程中茶多酚、茶黄素、茶红素、茶褐素之间的转化过程和功效特点。专利cn116334146a公布了一种红茶双酵母发酵产物、化妆品及其制备方法和应用，以红茶为发酵底料，以粉状毕赤酵母和酿酒酵母双菌种液态有氧发酵制得。在该专利所述的发酵条件下，能促进红茶细胞释放茶多酚，提高红茶发酵滤液中所含茶多酚的含量，使红茶发酵产物具有显著的抗氧化效果。但现有研究和相关专利中均未考虑茶多酚与茶黄素、茶红素、茶褐色的含量、转化程度和功效差异化。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种具有抗衰老功效的红茶发酵液的制备方法，采用特定的双菌菌株进行发酵，制备得到一种富含茶多酚、茶红素、茶黄素、茶褐素的红茶发酵液。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种红茶发酵液的制备方法，包括如下步骤：

4、（1）分别将库德毕赤酵母菌、杆菌于液体培养基中培养得到库德毕赤酵母菌种子液和杆菌种子液；所述杆菌为分泌单宁酶的杆菌；

5、（2）将红茶粉加入至液体培养基得到发酵培养基，接种步骤（1）得到的库德毕赤酵母菌种子液和杆菌种子液进行发酵得到粗发酵液；

6、（3）将步骤（2）得到的粗发酵液灭活、过滤、调配得到所述红茶发酵液。

7、本发明经过大量实验探究发现，采用特定的双菌种：库德毕赤酵母菌和杆菌对红茶进行发酵可制备得到一种富含茶多酚、茶红素、茶黄素、茶褐素的红茶发酵液。其中，库德毕赤酵母菌又被称为“东方伊萨酵母”，其代谢酶系丰富，能促进红茶细胞破裂释放出茶多酚（主要为儿茶素类）、茶红素、茶黄素、茶褐素等活性物质。而本发明采用的杆菌菌种在发酵过程中，能分泌单宁酶，单宁酶能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使酯型儿茶素水解转化为更加稀有、难获得的茶红素、茶黄素，并进一步转化为茶褐素。本发明选择库德毕赤酵母菌和杆菌联合进行发酵，具有其创新和独特性：库德毕赤酵母菌可作为单宁酶的“控制开关”：一方面，能快速降低杆菌发酵过程中产生的乳酸、乙酸等有机酸，保持发酵体系ph平衡，保持单宁酶活性；另一方面，库德毕赤酵母菌发酵过程中产生乙醇等多元醇，达到一定量时可以抑制单宁酶活性，“关闭”转化，从而实现茶多酚、茶红素、茶黄素和茶褐素的动态平衡。

8、优选地，所述分泌单宁酶的杆菌包括嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、木醋杆菌、费氏柠檬酸杆菌、特基拉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少一种。

9、更优选地，所述分泌单宁酶的杆菌为嗜酸乳杆菌。

10、优选地，所述步骤（1）中，库德毕赤酵母菌、杆菌在接种液体培养基前先进行平板传代复苏培养；所述培养条件为在25-35℃的温度下活化培养2-3代，每代培养时间12-24h。

11、优选地，所述步骤（1）中，库德毕赤酵母菌种子液、杆菌种子液中菌种的浓度均不低于1×108cfu/ml。

12、更优选地，所述库德毕赤酵母菌种子液、杆菌种子液中菌种的浓度为1×108cfu/ml。

13、优选地，所述步骤（1）、（2）中，液体培养基按照总重量份为1000份计，包括如下重量百分比的组分：蛋白胨5-15份、牛肉膏5-15份、酵母膏3-7份、葡萄糖15-25份、柠檬酸1.5-3.0份、柠檬酸钠2.0-3.5份、mgso4·7h2o 1-3份、mnso4·4h2o 0.05-0.1份、去离子水余量；所述液体培养基的起始ph为4.0-5.0。

14、本发明所用的培养基为传统培养基，适用于工业生产，操作简便，稳定性较好，调节ph至微酸，可使得所述培养基更适用于微生物的生长，进而影响发酵效果。

15、优选地，所述红茶选自福建武夷山正山小种、黄山祁门红茶、昭平红、霍红、滇红、越红、泉城红、苏红、川红或东江楚云仙红茶。

16、优选地，所述步骤（2）中，红茶粉由红茶经过粉碎、灭菌处理得到；所述粉碎的颗粒度为100目；所述灭菌的条件为在0.1mpa压力、121℃温度下灭菌20 min。

17、优选地，所述步骤（2）中，所述发酵培养基中红茶粉的质量百分含量为2-5%。

18、优选地，所述库德毕赤酵母菌种子液和杆菌种子液的总接种量为液体培养基总体积的4%-10%；所述库德毕赤酵母菌种子液的接种量与杆菌种子液接种量的体积比为（2-5）：（2-6）。

19、杆菌发酵过程中会产生大量乙酸或者乳酸等有机酸，过低的ph会抑制单宁酶等生物酶的活性。本发明经大量实验探究发现，库德毕赤酵母菌种子液和杆菌种子液的体积比为上述特定比例时，库德毕赤酵母菌作为单宁酶的“控制开关”，调控茶多酚与茶黄素等色素间的转化终点，控制深度转化程度，抑制茶褐素的过多转化。从而获得富含茶多酚、茶黄素、茶红素、茶褐素的红茶发酵液，尤其是其中的茶黄素和茶红素，使其具有调节细胞代谢和功能、修护线粒体氧化损伤、增强细胞活力、抗衰老功效。

20、更优选地，所述库德毕赤酵母菌种子液的接种量与杆菌种子液接种量的体积比为1：1。

21、优选地，所述步骤（2）中，发酵条件为：发酵过程中通气量为0.5-1.0vvm，发酵温度25-35℃，转速100-300 r/min，发酵时间24-72 h，ph为3.0-5.0。

22、更优选地，所述步骤（2）中，发酵条件为：发酵温度28℃，转速150 r/min，发酵时间48 h。

23、优选地，所述步骤（3）中，灭活的条件为90-100℃下处理15-30 min。

24、优选地，所述步骤（3）中，过滤包括粗过滤和细过滤；所述粗过滤的过滤精度为1.2μm；所述细过滤的过滤精度为0.45μm。

25、优选地，所述粗过滤采用板框过滤器或硅藻土过滤器进行过滤，板框过滤器的过滤面积为1 m2，过滤精度为1.2μm；所述细过滤采用卧式离心机或陶瓷膜过滤器进行过滤，过滤精度为0.45μm。

26、优选地，所述调配的方法为往红茶发酵液中加入防腐剂。

27、优选地，所述防腐剂包括如下组分：丁二醇、己二醇、戊二醇、对羟基苯乙酮、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸中的至少一种。

28、优选的，所述防腐剂包括如下重量份数的组分：1,3-丁二醇2-5份、1,2-己二醇0.3-1份、对羟基苯乙酮0.3-1份。

29、第二方面，本发明提供了上述的红茶发酵液的制备方法制备得到的红茶发酵液。

30、第三方面，本发明提供了上述的红茶发酵液在食品、化妆品、保健品中的应用。

31、本发明所述制备方法得到的红茶发酵液富含茶多酚、茶红素、茶黄素、茶褐素等活性组分，应用于食品、化妆品、保健品中，具有抑制线粒体膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化生成-丙二醛，恢复线粒体功能，促进线粒体高能磷酸化合物（atp细胞能量之源，细胞能量代谢调节的关键分子）生成，提供细胞活跃和再生的能量供给；促进细胞分泌胶原蛋白，抑制人体衰老的功效。

32、本发明的有益效果为：

33、本发明采用库德毕赤酵母菌、杆菌与红茶进行共生发酵，制备了一种红茶发酵液；所得红茶发酵液富含茶多酚、茶红素、茶黄素、茶褐素，具有调节细胞代谢和功能、修护线粒体氧化损伤、增强细胞活力、抗衰老等效果，可应用在食品、化妆品、保健品中。

34、本发明所用菌种均为有益的、可安全使用的菌株，制备得到的红茶发酵液富含茶多酚、茶红素、茶黄素、茶褐素等茶色素，具有实际应用意义。