一种肝细胞癌微血管侵犯的诊断模型及其构建方法和用途

本发明属于医学检验，具体涉及一种肝细胞癌微血管侵犯的诊断模型及其构建方法和用途。

背景技术：

1、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是原发性肝癌中较为常见的一种类型，是全球癌症相关死亡的第四大主要原因。以肝切除和移植为主的外科手术依旧是目前有效的治疗手段。尽管如此，术后复发率依旧不低，切除术后的5年复发率为50～70％，移植术后的5年复发率为30～35％。肝细胞癌具有易转移和高复发的特点，在发展过程中很容易侵犯血管，形成微血管侵犯(microvascular invasion，mvi)。微血管侵犯是hcc预后不良的独立危险因素，伴mvi的hcc患者复发率显著高于无mvi的hcc患者，其5年复发率高达60～70％。因此，术前明确mvi状态对治疗方案的制定以及患者预后的改善具有重要意义。

2、现阶段，mvi的诊断“金标准”依赖于肿瘤病灶的病理学检查，但病理学检查结果易受到取材部位(如，肿瘤时空异质性)的影响，也无法在术前为临床提供是否存在mvi的信息。影像学诊断mvi是目前较为常见的手段，通过特征图像的识别从而判断mvi的状态，但特征图像的提取依赖于有经验的临床医生，而且结果判断相对主观且耗时。其次，影像学方法对mvi的检出率不佳，如增强计算机断层成像(computed tomography，ct)检出率为30～50％，增强磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)检出率为40～60％，超声造影检出率为20～40％。因此，亟需新型、有效的术前mvi诊断方法，以弥补现有诊断手段在术前诊断方面的不足，也为临床决策提供更及时、准确的依据。

3、越来越多研究揭示蛋白组学和代谢组学在hcc发生发展中的作用。本发明通过检测有mvi和无mvi的hcc患者血液中代谢物的变化，从中筛选出与mvi相关的代谢物，联合术前临床肿瘤指标，建立得到高敏感度和高特异性的术前mvi诊断模型。本发明提供的术前mvi诊断模型以无创形式获得多维数据，准确预测肝细胞癌患者mvi状态，为mvi术前诊断提供新思路。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有手段对术前mvi诊断的缺失，以及敏感度和特异性不足的缺陷，提供一种能提高mvi有效检出率的诊断模型。具体的，本发明以肝细胞癌患者血液中代谢物作为切入，联合术前临床肿瘤指标，发现pivka-ii、ggt、l-丝氨酸(l-serine)、肌氨酸(sarcosine)和肿瘤大小对肝细胞癌mvi的形成具有重要意义，并基于上述诊断指标建立得到一种基于多组学、多维度的诊断模型，用于肝细胞癌患者术前mvi的诊断。

2、在本发明的第一方面，本发明提供一种诊断指标或检测诊断指标的试剂在制备术前诊断肝细胞癌微血管侵犯的产品中的用途，所述诊断指标为pivka-ii、ggt、l-serine、sarcosine和肿瘤大小。

3、所述产品包括但不限于模型、试剂盒、膜条、芯片或检测平台。

4、若没有特别限定，本发明所述的检测诊断指标的试剂为本领域技术人员已知的可检测pivka-ii、ggt、l-serine、sarcosine和肿瘤大小的试剂或者手段。

5、在本发明的第二方面，本发明提供一种肝细胞癌微血管侵犯诊断指标的获取方法，所述方法包括：将肝细胞癌患者按照有无mvi分组；对患者代谢组数据进行差异分析和富集通路分析，筛选得到与mvi相关的代谢物；采用单因素和多因素二元logistic回归分析，以p<0.05为阈值筛选得到肝细胞癌微血管侵犯诊断指标。

6、优选的，所述肝细胞癌微血管侵犯诊断指标的获取方法包括如下步骤：

7、(1)将hcc患者按照有无mvi进行分组，使用uhplc-ms检测hcc患者血液样本中的代谢物组成，获得代谢组数据；

8、(2)对代谢组数据进行差异分析和富集通路分析，筛选出与mvi相关的代谢物；

9、(3)收集hcc患者的术前临床肿瘤指标；

10、(4)采用单因素分析，以p<0.05为阈值，筛选出与hcc患者mvi相关的指标；

11、(5)在步骤(4)得到的候选指标中采用多因素分析，以p<0.05为阈值，筛选得到诊断指标，所述诊断指标由pivka-ii、ggt、l-serine/sarcosine和肿瘤大小组成。

12、在本发明的具体实施方式中，所述肝细胞癌微血管侵犯诊断指标的获取方法包括如下步骤：

13、(1)将hcc患者按照有无mvi进行分组，使用uhplc-ms检测hcc患者血液样本中的代谢物组成，获得代谢组数据；

14、(2)采用opls-da对代谢物和mvi状态进行分析，筛选vip>1且p<0.05的差异代谢物；随后对差异代谢物进行基于kegg数据库的富集通路分析，筛选出影响值>0.2的代谢物；

15、(3)收集患者术前临床指标，包括甲胎蛋白、异常凝血酶原ii(protein inducedby vitamin k absence or antagonist-ii，pivka-ii)、白蛋白、总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transferase，ggt)、乙肝表面抗原、肿瘤大小、肿瘤数量和中国肝癌分期方案分级；

16、(4)采用单因素二元logistic回归分析步骤(2)和(3)获得的单个因素对mvi的影响，筛选与mvi相关的p<0.05的指标；

17、(5)采用多因素二元logistic回归分析步骤(4)获得的多个因素对mvi的影响，筛选p<0.05的指标作为诊断指标。

18、在本发明的第三方面，本发明提供一种肝细胞癌微血管侵犯诊断模型的构建方法，所述方法包括以本发明第二方面所述的筛选方法得到的诊断指标为变量，根据多因素二元logistic回归分析得到的线性系数构建得到诊断模型。

19、本发明所述的肝细胞癌微血管侵犯诊断模型通过如下方法制备得到：

20、将hcc患者按照有无mvi分组；对患者代谢组数据进行差异分析和富集通路分析，筛选得到mvi相关的代谢物；采用单因素和多因素二元logistic回归分析，以p<0.05为阈值筛选得到肝细胞癌微血管侵犯诊断指标；以所述诊断指标为变量，根据多因素二元logistic回归分析得到的线性系数构建得到诊断模型。

21、优选的，所述的肝细胞癌微血管侵犯诊断模型通过如下方法制备得到：

22、(1)将hcc患者按照有无mvi进行分组，使用uhplc-ms检测hcc患者血液样本中的代谢物组成，获得代谢组数据；

23、(2)对代谢组数据进行差异分析和富集通路分析，筛选出与mvi相关的代谢物；

24、(3)收集hcc患者的术前临床肿瘤指标；

25、(4)采用单因素分析，以p<0.05为阈值，筛选出与hcc患者mvi相关的指标；

26、(5)在步骤(4)得到的候选指标中采用多因素分析，以p<0.05为阈值，筛选得到诊断指标，所述诊断指标由pivka-ii、ggt、l-serine/sarcosine和肿瘤大小组成；

27、(6)以步骤(5)所述的诊断指标为变量，根据多因素二元logistic回归分析得到的线性系数构建得到诊断模型。

28、在本发明的具体实施方式中，所述的肝细胞癌微血管侵犯诊断模型通过如下方法制备得到：

29、(1)将hcc患者按照有无mvi进行分组，使用uhplc-ms检测hcc患者血液样本中的代谢物组成，获得代谢组数据；

30、(2)采用opls-da对代谢物和mvi状态进行分析，筛选vip>1且p<0.05的差异代谢物；随后对差异代谢物进行基于kegg数据库的富集通路分析，筛选出影响值>0.2的代谢物；

31、(3)收集患者术前临床指标，包括甲胎蛋白、pivka-ii、白蛋白、总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、ggt、乙肝表面抗原、肿瘤大小、肿瘤数量和中国肝癌分期方案分级；

32、(4)采用单因素二元logistic回归分析步骤(2)和(3)获得的单个因素对mvi的影响，筛选与mvi相关的p<0.05的指标；

33、(5)采用多因素二元logistic回归分析步骤(4)获得的多个因素对mvi的影响，筛选p<0.05的指标作为诊断指标；

34、(6)以步骤(5)所述的诊断指标为变量，根据多因素二元logistic回归分析得到的线性系数构建得到诊断模型。

35、在本发明的第四方面，本发明提供一种肝细胞癌微血管侵犯的诊断模型，所述诊断模型通过本发明第三方面所述的方法构建得到。

36、在本发明的具体实施方式中，所述肝细胞癌微血管侵犯的诊断模型为：

37、

38、以8.344为cut-off值进行诊断效能评估。当y值>8.344时，表示该肝细胞癌患者发生mvi；当y<8.344时，表示该肝细胞癌患者未发生mvi。

39、本发明提供的模型可以在术前诊断患者是否有mvi，有助于选择合适的治疗方案，从而有效降低患者术后转移复发概率，提高患者生存质量，延长患者生存时间，为基于微血管侵犯预测肝细胞癌预后的临床应用提供了可行方案。

40、本发明提供的模型在术前对hcc患者mvi状态具有较好的诊断效能，实验验证该模型的auc面积为0.896，显著高于单一指标，如aucpivka-ii＝0.787、aucggt＝0.721、aucl-serine/sarcosine＝0.737和auc肿瘤大小＝0.614。该模型的临床敏感度和特异性分别为80.0％和87.2％，显著高于现阶段的诊断手段。

41、在本发明的第五方面，本发明提供一种本发明第四方面所述的模型在如下至少一项中的用途：

42、(1)在制备用于术前肝细胞癌mvi诊断或辅助诊断的产品中的用途；

43、(2)在制备用于肝细胞癌预后评估或辅助评估的产品中的用途。

44、本发明提供的用于肝细胞癌mvi诊断的模型及其构建方法具备如下技术优势：

45、针对肝细胞癌易转移高复发的特点，在术前预测微血管侵犯对临床治疗方案选择和改善患者预后具有重要意义。本发明首先采用超高效液相色谱质谱仪(ultra highperformance liquid chromatography-mass spectrometer，uhplc-ms)检测肝细胞癌患者血液样本中代谢物的组成，获得代谢组数据；再采用正交矫正偏最小二乘法判别分析法(orthogonal partial least-squares discriminant analysis，opls-da)对代谢物和mvi状态进行分析，以变量投影重要性(variable importance in the projection，vip)>1和p<0.05为阈值，筛选出差异代谢物；基于京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopediaof genes and genomes，kegg)数据库对筛选出的代谢物进行富集通路分析，限定影响值>0.2为阈值，筛选出对mvi影响最显著的代谢物；随后，联合候选代谢物和临床肿瘤特征，采用单因素分析筛选出与mvi相关的影响因素；将单因素分析中p<0.05的指标纳入多因素分析，选取p<0.05的指标，即pivka-ii、ggt、l-serine/sarcosine和肿瘤大小的组合作为用于诊断肝细胞癌mvi的诊断指标；进一步以该诊断指标为变量，根据多因素二元logistic回归分析得到的线性系数构建得到诊断模型。

46、本发明提供的诊断模型涉及多组学、多维度的标志物，以无创的方式通过血液和影像获得相关标志物，并入模型进行评分计算，实现安全、无创的术前mvi诊断，对治疗方案的制定以及患者预后的改善具有重要意义。