一种酸/还原敏感的聚合物囊泡于肿瘤原位加快生物正交催化的方法

本发明技术涉及高分子材料的聚合物囊泡化、亲/疏水前驱体和铜离子的共同递送和可控铜螯合加速的生物正交催化。

背景技术：

1、传统前药的活化依赖人体的酸、酶、硫醇、活性氧等微环境，而这些环境往往受到酶活性、年龄相关的生理变化、药物互作等因素影响。生物正交催化疗法是新兴的前药治疗技术。该疗法仅依赖过渡金属的高效催化，具有更稳定的活化能力、更高的肿瘤特异性和更低的脱靶风险。铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)反应频繁出现于各种生物正交催化治疗方案中，得益于铜离子价格低廉和催化高效、前驱体结构简单、产物的成药性好和化学结构和体内代谢稳定。过往研究表明，纳米材料共递送前驱体和精准控制具有催化活性的一价铜离子(cu+)的产生有利于提高生物正交催化效率。然而，铜催化体系的局限性是铜毒性(主要由cu+产生)和铜离子的不稳定性(如：二价铜(cu2+)会被炔烃还原；cu+易发生氧化或歧化)。现有纳米技术的瓶颈在于不能真正意义上安全地共同递送亲/疏水前驱体和cu2+，以及在肿瘤细胞内复杂的生理环境下形成稳定的cu+结构。技术上的瓶颈带来的是低效的体内递送和原位催化，随后面临使用高剂量铜离子的毒副作用。

2、铜催化的生物正交反应面临的问题有：cu2+会被炔烃还原成cu+；cu+易发生氧化或歧化；反应需要稳定的cu+结构；铜离子的系统毒性。这些瓶颈使得生物正交催化疗法仍然存在改善的空间，以进一步提高肿瘤原位催化效率的方式来降低外源铜离子的剂量，提高生物安全性。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的在于提出一种酸/还原敏感的聚合物囊泡于肿瘤原位加快生物正交催化的方法。由双硫键连接的透明质酸-聚己内酯共聚物(ha-ss-pcl)形成的聚合物囊泡能够在空间上将叠氮化物、炔烃和cu2+分隔在内水相、疏水层和亲水表面，实现高效的前驱体/催化剂共递送系统。通过调节共聚物亲水片段和疏水片段的分子量，制备了在正常生理环境下结构稳定，在酸/还原环境下快速响应的纳米囊泡。该囊泡在肿瘤细胞内环境下，表面膜发生穿孔，使得内水相的亲水前驱体(叠氮化物)优先地由内而外释放，并与表层附近的cu+螯合；随后，纳米囊泡在酸/还原环境下进一步解体，缓慢释放出疏水前驱体(炔烃)。螯合物的形成有助于稳定cu+的结构并拉近叠氮基与cu+催化中心的距离，从而提高cu+催化的生物正交反应的效率。这种由纳米囊泡程序化释放控制的先螯合、后催化行为在肿瘤原位实现高效的生物正交催化治疗，使得该纳米疗法对铜离子需求量低，降低了外源铜带来的生物安全性风险。

2、技术方案：本发明所述的酸/还原敏感的线性共聚物形成的纳米囊泡材料，所述的线性嵌段共聚物是将特定分子量的透明质酸和聚己内酯两个嵌段经双硫键偶联得到；该共聚物自组装形成的纳米囊泡能够将亲水性前驱体azide、疏水性前驱体alkyne和二价铜离子cu2+物理地分隔在内水相、疏水层和纳米囊泡外表面；该纳米囊泡响应肿瘤微环境条件并且程序性释放所装载的两种前驱体和铜离子。所述共聚物经双硫键线性共聚特定分子量的透明质酸和聚己内酯得到，由此组装而成的纳米囊泡的高稳定性得益于疏水层聚己内酯之间的紧密缠绕。所述囊泡在酸/还原条件刺激下，逐渐发生聚己内酯水解和二硫键断裂，导致膜穿孔，从而引发内水相的亲水性前驱体优先地从内向外释放；疏水层的疏水性前驱体则随着纳米囊泡的不断解体而缓慢释放。

3、所述纳米囊泡材料包封的前驱体包含亲水前驱体和疏水前驱体；所述疏水前驱体是炔烃；所述亲水前驱体是叠氮化物，而且还包含具有增加cu+稳定性和促进cu+催化性能的螯合亚铜离子的结构，所述结构包括异羟肟酸、咪唑基、吡啶、喹啉、酞菁、卟啉。在酸/还原环境下，所述亲水前驱体优先从纳米囊泡的内水相释放后，与表层附近被谷胱甘肽(gsh)还原的cu2+螯合。该螯合物能够稳定cu+的结构和拉近叠氮基和铜催化中心的距离，提高了后续生物正交催化的速率。

4、所述的纳米囊泡材料，所述纳米材料的活体血液循环时间(t1/2)大于8小时，在肿瘤原位形成cu(i)-azide螯合物，促进生物正交催化的药物合成。

5、所述纳米材料静脉注射至活体内(balb/c小鼠)后，能够显著延长亲/疏水前驱体的半衰期，并利用透明质酸靶向肿瘤的能力高效地共递送前驱体和铜离子至肿瘤部位；该纳米囊泡的特殊酸/还原敏感结构能够在肿瘤细胞内环境下通过膜孔化优先释放亲水性前驱体与cu+螯合，在原位引发螯合促进的生物正交催化的治疗。

6、所述的纳米囊泡材料的制备方法，包括以下步骤：两亲性共聚物透明质酸-双硫键-聚己内酯和疏水前驱体溶解于二甲基亚砜溶剂中，亲水前驱体溶解于水溶剂中，通过溶剂转换法将两种前驱体封装在透明质酸-双硫键-聚己内酯构成的纳米囊泡中；铜离子通过非共价作用力与囊泡表面的透明质酸上的化学基团配位。

7、所述的制备方法，所述共聚物透明质酸-双硫键-聚己内酯的分子量范围是10-100kda，其中透明质酸和聚己内酯的分子量分布范围在5-50kda。

8、所述的制备方法，所述溶剂转换法的具体操作为：在室温条件下，搅拌条件为600-1200rpm，将水溶剂滴加至二甲基亚砜溶剂中。

9、所述的制备方法，封装两种前驱体后的纳米囊泡，转移至透析袋中，在cucl2水溶液中透析1-24小时。

10、所述的制备方法，cucl2水溶液的浓度范围是0.1-10mg/ml。

11、所述的纳米囊泡材料在制备生物正交催化治疗领域的药物中的应用。

12、所述的纳米囊泡材料在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。

13、所述的应用，所述恶性肿瘤包括乳腺癌。

14、所述纳米囊泡材料在空间上对前驱体和催化剂进行物理分隔，能够避免因cu2+被炔烃类前驱体还原为cu+而产生二炔类副产物和不可控的cuaac反应。

15、所述纳米囊泡材料中的两种前驱体为原药的两个部分，在它们完成cuaac反应后，较之原药具备相当的药物活性。

16、所述纳米囊泡材料具有膜孔化后由内向外释放药物的能力，即肿瘤细胞内的ph/gsh环境能够在纳米材料的膜表面穿孔，使得纳米材料内的亲水前驱体优先释放。

17、所述纳米囊泡材料优先释放的亲水性前驱体能够与纳米材料表层区域中已被gsh还原的cu+螯合，以此稳定cu+的结构和拉近叠氮基与cu+的距离，从而提高铜催化的效率。

18、所述cu+仅由前驱体螯合，无额外的配体参与。

19、本发明的由聚合物自组装形成的囊泡状纳米反应器在肿瘤细胞内启动螯合促进的生物正交催化示意图见图1。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明公开的基于聚合物囊泡构建的多组分隔离的共递送系统具有以下效果：(1)通过囊泡状纳米结构将亲水/疏水的前驱体和cu2+物理地分隔在内水相、疏水层和亲水表面，可有效避免前驱体与二价铜之间发生副反应和提前反应；(2)ph/gsh驱动的膜孔化行为使得纳米囊泡内的亲水前驱体优先释放，与外部的cu+发生螯合，稳定了cu+的结构并拉近了叠氮基与cu+的距离，从而提高铜催化的效率；(3)三种物质(azide，alkyne和cu2+)的共递送和前驱体-铜螯合后提高的催化效率使得该疗法对外源铜的需求明显降低，改善了纳米囊泡的生物安全性。