携带氨基酸和胶原肽的外泌体及其制备方法和应用与流程

本技术总体上涉及生物医药，更具体地说，涉及携带氨基酸和胶原肽的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、年龄增长、自由基积累、紫外线照射、环境污染以及不良生活习惯是导致皮肤衰老的主要因素。皮肤衰老不仅是美容领域的热点问题，也直接影响着公众的健康。从外观上看，衰老皮肤表现为松弛、下垂、皱纹加深和黑色素沉积；从组织学层面分析，衰老皮肤通常表现为表皮和真皮层的萎缩、表皮网状嵴变平，以及成纤维细胞和肥大细胞数量的减少。此外，衰老还伴随着胶原纤维的数量减少、iii型胶原与i型胶原比例失衡，进一步削弱皮肤的支撑力和弹性。紫外线、蓝光和污染等外界因素还会引发皮肤组织的炎症反应。在这一过程中，免疫细胞如肥大细胞和巨噬细胞会释放大量炎症因子，刺激蛋白水解酶和基质金属蛋白酶(mmps)的生成，进一步破坏皮肤中的胶原蛋白和弹性纤维，导致细胞外基质的崩解并加速皮肤老化。皮肤衰老的各种机制最终指向一个核心因素——胶原蛋白的流失。

2、胶原蛋白是皮肤中最重要的结构蛋白之一，它不仅提供组织的支撑力和强度，还通过维持组织的完整性赋予皮肤弹性和光泽。胶原蛋白能在受损组织中重新建立连接，促进皮肤修复和再生。此外，胶原蛋白在伤口愈合和减少炎症方面也起着至关重要的作用。然而，随着年龄的增长，胶原蛋白的合成逐渐减少，降解速度却加快，这使皮肤的结构完整性和功能逐步退化。

3、然而，胶原蛋白的实际应用面临诸多技术瓶颈。首先，由于胶原蛋白分子量较大，其透皮吸收效率低，难以有效穿透皮肤屏障，难以达到深层组织，进而影响其实际效果。其次，胶原蛋白的化学性质相对不稳定，容易受到光、热及氧化等环境因素的影响，导致其活性丧失。此外，胶原蛋白的系统性应用可能引发副作用，如局部刺激或过敏反应，限制了其在皮肤护理产品中的广泛应用。

4、外泌体是一种由细胞分泌的纳米级膜性囊泡，近年来在生物医学领域，特别是在药物递送方面，展现出了广泛的应用前景。外泌体具有优异的生物相容性，能够被机体细胞高效识别和摄取。其天然的膜结构使其能够穿越皮肤屏障，且避免引发免疫反应。这一独特特性使外泌体成为理想的药物递送载体，尤其在精准靶向递送活性分子至真皮层方面，展现出显著优势。

5、因此，为克服胶原蛋白在实际应用中的技术难题，提高胶原蛋白的合成效率、增强其透皮吸收效率以及减少潜在副作用提出了本发明。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术提供了携带氨基酸和胶原肽的外泌体及其制备方法和应用，氨基酸和胶原肽是胶原蛋白合成的基础原料，直接参与胶原纤维的形成，进一步促进胶原蛋白的合成和组织修复；外泌体的纳米级尺寸和独特的膜结构，使其能够顺利穿过皮肤屏障，确保氨基酸和胶原肽深入皮肤深层，能够有效促进皮肤胶原蛋白的再生从而显著增强抗衰老效果。

2、为了达到上述目的，本技术提供如下技术方案：

3、本技术提供一种携带氨基酸和胶原肽的外泌体的制备方法，包括如下步骤：(1)多种来源外泌体的提取；(2)氨基酸和胶原肽的封装，所述氨基酸包括甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸、天冬氨酸及胱氨酸；(3)纯化去除未结合成分；(4)外泌体粒径和形态检测；(5)封装率计算；(6)细胞模型验证抗衰老效果；(7)在实际应用中的抗皱效果评估。

4、优选地，外泌体的提取来源包括多种细胞、组织及体液来源。例如：间充质干细胞(如骨髓来源(bm-mscs)、脂肪来源(ad-mscs)、脐带来源(uc-mscs)、胎盘来源(pl-mscs))、乳汁来源(如人乳、牛乳、羊乳、马乳、骆驼乳、鹿乳)、血液来源(如人体血液、动物血液)以及诱导多能干细胞(ipscs)来源的外泌体。

5、更优选地，对于不同来源采取不同处理方式：对于细胞来源：包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘来源的间充质干细胞及诱导多能干细胞(ipscs)，首先培养相应细胞并使其达到对数生长期，然后收集细胞培养上清液，随后进行常规外泌体提取。对于组织来源：包括脐带、胎盘及其他组织来源，首先通过组织匀浆处理提取上清液，再进行常规外泌体提取。对于体液来源：包括乳汁、血液等体液来源，收集新鲜样本后，使用40μm滤网进行初步过滤，去除脂肪颗粒和较大颗粒物质，之后再进行常规外泌体提取。

6、优选地，所述步骤(1)包括：初步离心：将多种外泌体来源样本在室温下以3,000×g离心两次，每次10分钟；精细化过滤：使用0.22μm过滤器对上清液进行连续过滤，以去除残余杂质；超滤浓缩：采用100k道尔顿超滤管进行超滤，依次在6,000×g的条件下进行4分钟、7分钟、14分钟和30分钟的短时间离心，重复该过程直至处理完所有上清液，得到浓缩后的外泌体样品；pbs清洗：向浓缩样品中加入pbs溶液，进行2-3次清洗，以去除残留的培养基；无菌过滤与保存：使用无菌过滤器过滤外泌体样品，将其分装至冻存管中，并在-80℃下保存。

7、优选地，在所述步骤(2)中，氨基酸和胶原肽的封装过程采用电穿孔法，使用电穿孔仪进行微电流穿孔，微电流穿孔的条件设置为ca-137模式。

8、优选地，在所述步骤(2)中，氨基酸和胶原肽的用量如下：胶原肽0.2g～0.4g、甘氨酸0.1g～0.2g、脯氨酸0.1g～0.2g、精氨酸0.1g～0.2g、赖氨酸0.1g～0.2g、羟脯氨酸0.1g～0.2g、天冬氨酸0.1g～0.2g、胱氨酸0.1g～0.2g，所有成分均溶解于1ml外泌体溶液中。

9、优选地，所述步骤(3)包括：选择100k道尔顿分子截留限的超滤管，微电流穿孔后的混合溶液稀释至15ml加入超滤装置中，以6,000×g的离心力进行超滤，初次离心时间为10-15分钟，重复超滤步骤2-3次，每次超滤后加入pbs或其他缓冲液，调整溶液体积，完成超滤后，收集超滤管中浓缩的外泌体溶液。

10、优选地，在所述步骤(4)中，使用纳米颗粒跟踪分析仪(nta)对超滤步骤中收集的外泌体溶液进行粒径分析，外泌体的粒径约为115nm(见图2)。此外，取一部分外泌体样品，使用透射电子显微镜(tem)进行成像，观察外泌体的形态和结构，以确认其完整性及形态特征(见图1)。

11、优选地，在所述步骤(5)中，氨基酸含量检测采用液相色谱仪(1260型，安捷伦科技有限公司)。对外泌体溶液中的七种氨基酸(甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、胱氨酸)进行定量分析。首先，配制各氨基酸的标准溶液并建立标准曲线。然后，将待测外泌体样品经过前处理后进行液相色谱分析，通过与标准曲线比较，得到每种氨基酸在样品中的浓度。

12、优选地，胶原肽含量检测也使用液相色谱仪(1260型，安捷伦科技有限公司)。以纯化胶原肽作为标准品，建立标准曲线，并测定外泌体样品中的胶原肽含量。

13、优选地，通过比较外泌体加载前(初始加入量)与加载后(经过超滤及清洗步骤去除未包裹成分后的含量)实际检测到的氨基酸和胶原肽含量，计算包封率(ee)。

14、优选地，在所述步骤(6)中，建立抗衰老功效的细胞模型验证，为了评估携带amisyn的外泌体在抗衰老方面的效果，选择人皮肤成纤维细胞(hsf)作为实验模型。通过连续传代至第10代，建立衰老细胞模型。将第10代衰老细胞随机分为三组：对照组(pbs缓冲液)、exo组(添加未经活性成分包裹的外泌体溶液)和pro-exo组(添加携带amisyn的外泌体)。各组细胞在标准培养条件下培养24小时后，收集细胞样本进行基因表达分析。

15、优选地，在步骤(7)中，进行实际应用中的抗皱效果评估。为了进一步评估携带amisyn的外泌体在实际应用中的抗皱效果，设计了临床效果评估实验。选择符合试验要求的中国健康男性或女性，年龄在40至60岁之间，随机分为三组，每组10人，共30人，进行抗皱效果评估。

16、本发明还提供了一种通过以上任一项所述的制备方法制备的携带氨基酸和胶原肽的外泌体，及其在抗皮肤衰老和皮肤护理中的应用。

17、本技术所提供的携带氨基酸和胶原肽的外泌体的制备方法，由于通过外泌体搭载胶原蛋白合成的基础原料amisyn，能够促进胶原蛋白的合成和组织修复，并且采用外泌体作为载体，双层磷脂能够隔离外界环境中的氧气、紫外线和水分，减少氧化、光降解和水解的风险，从而延长其活性成分的有效期。与传统方法相比，本发明的外泌体的提取过程简便且成本较低。由于外泌体具有优异的生物相容性，通常不会引发显著的免疫反应或毒性，因此其安全性较高。此外，外泌体与人体细胞膜的成分相似，可以有效与细胞膜融合，从而确保活性物质能够靶向性地进入细胞并被充分吸收。外泌体天然的生物相容性使其成为理想的药物递送载体，有助于减少不良反应的发生。外泌体的纳米级尺寸和独特的膜结构使其能够穿透生物屏障，如皮肤屏障和血脑屏障，从而实现更加高效的药物递送。外泌体不仅能够延长药物的释放时间，还能增强治疗效果，并确保活性成分稳定地传递至目标组织。此外，外泌体还含有多种生物活性分子，如蛋白质、脂类和rna，这些成分可能具备免疫调节作用，有助于在药物递送过程中提供额外的治疗效益。

18、综上所述，本技术的携带amisyn的外泌体提供了一种更加安全、温和且有效的抗衰老解决方案，相较于传统抗衰老疗法，本方案有效避免了可能引发的副作用，且具有广阔的应用前景。