一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子及其制备方法

本发明涉及医药制备，具体涉及一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子及其制备方法。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌是一种主要的人类病原体，具有一系列毒力因子并能够对大多数抗生素产生耐药性。生物被膜是细菌为了抵御恶劣的环境条件，包裹自身并在细胞外聚合物基质（eps）中聚集而形成的一种细菌聚集膜样物。其中eps 在生物被膜中占比高达 80%，它能保护内部细菌免受来自外界毒性物质的侵害，从而为有效的抗菌药物创造了强大的天然屏障，并且能够逃避宿主细胞的免疫系统，而 mrsa 生物膜的形成则进一步加剧 了mrsa 感染的严重程度，并表现出顽固的耐药性和耐受性。

2、传统抗生素治疗可诱导产生严重的细菌耐药性，进一步挑战现有药物和治疗方案的可用性。因此，制定有效根除耐药细菌的新策略至关重要。近年来，光动力疗法已成为治疗微生物感染的有效方式。其原理是激光照射光敏剂达到激发态，在内在系统交互作用下，激发态光敏剂释放的能量将氧气转化为具有杀伤性的活性氧自由基。然而，在缺氧的细菌微环境中，光动力效应可能会加剧细菌微环境缺氧，甚至促进细菌生长。因此，氧气的及时补充是增强光动力杀伤并且改善细菌缺氧微环境的关键。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，本发明目的在于提供一种用于增强光动力疗法和缓解生物膜缺氧的一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子。多聚赖氨酸-二氢卟吩e6（pllce6）负载预透明质酸修饰的过氧化钙纳米颗粒表面，通过增强细菌感染部位氧气浓度来增强氧依赖型光敏剂的光动力疗效。

2、本发明另一目的在于提供上述基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子的制备方法。该方法有效解决了有效成分二氢卟吩e6负载过程中，很难负载到过氧化钙表面，无法形成均匀负载有效成分的纳米复合材料的问题，从而使得ce6的催化活性有效提高，提高治疗效果。

3、本发明目的通过如下技术方案实现：

4、一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子，其特征在于：由透明质酸修饰的过氧化钙纳米颗粒为载体，在其表面负载了多聚赖氨酸-二氢卟吩e6（pllce6）形成的复合载药纳米粒子cao2@ha/pllce6，该复合载药纳米粒子为粒径100nm左右的球形颗粒。

5、进一步，所述多聚赖氨酸-二氢卟吩e6（pllce6）是阳离子光敏剂，具有较强的静电吸附能力。

6、一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子的制备方法，包括透明质酸修饰的过氧化钙纳米载体的制备和药效成分的复合，其特征在于：所述有效成分的复合是将有效成分多聚赖氨酸-二氢卟吩e6（pllce6）溶液滴加到透明质酸修饰的过氧化钙纳米材料的悬液中，将溶液置于旋转混悬仪上10 min，离心分离得到负载了pllce6的透明质酸修饰过氧化钙纳米粒子cao2@ha/pllce6。

7、进一步，所述pllce6溶液浓度为1mg/ml，透明质酸修饰的过氧化钙纳米材料的悬液浓度为1mg/ml。

8、将ce6和具有自供氧能力的过氧化钙纳米粒制备成复合粒子，可以解决ce6光动力效应过程中的缺氧问题。但是在将ce6附着到供氧的过氧化钙纳米粒表面过程中发现，ce6基本无法附着到过氧化钙纳米粒表面。本发明中通过多聚赖氨酸修饰ce6，转化成pllce6，再与透明质酸修饰的过氧化钙纳米粒进行复合，透明质酸钠通过带负电荷的离子和带正电荷的过氧化钙纳米晶体之间的吸引力，在过氧化钙纳米粒成核和生长的同时进行有效的修饰，形成cao2@ha，cao2@ha6再和pllce之间产生静电作用，使得pllce6均匀附着在cao2@ha表面，负载后形成带有弱正电性的cao2@ha/pllce6。

9、进一步，所述pllce6溶液和透明质酸修饰的过氧化钙纳米材料的悬液体积比为1:1~1.5。

10、进一步，多聚赖氨酸-二氢卟吩e6（pllce6）的合成步骤如下：

11、（1） n-羟基琥珀酰亚胺酯ce6（ce6-nhs）的合成：将n-羟基琥珀酰亚胺酯（nhs）、n,n'-二环己基碳二亚胺（dcc）和ce6溶解于干燥的dmso溶液中，避光室温反应24 h，得ce6-nhs；

12、（2）pllce6的合成：将n-乙基吗啉（nem）、聚赖氨酸（pll）和ce6-nhs溶解于dmso中，避光室温反应24 h后，透析冻干得到产物pllce6。

13、进一步，所述nhs、dcc、ce6和dmso的用量比为2~3mg:2~3mg:1mg:10ml。

14、进一步，所述nem、pll、ce6-nhs和dmso的用量比为0.8~1.2mg:0.8~1.2mg:5~7mg:10ml。

15、进一步，所述透明质酸修饰过氧化钙纳米复合材料是按照如下步骤制得：

16、（1）称取透明质酸钠和透明质酸加入到去离子水中，超声使其充分溶解得溶液1；

17、（2）向溶液1中加入氯化钙水溶液，室温快速搅拌混匀得溶液2；

18、（3）向溶液2中加入氢氧化钠水溶液，充分混匀的溶液3；

19、（4）向溶液3中逐滴加入过氧化氢溶液，继续室温快速搅拌得溶液4；

20、（5）将乳蓝色溶液4以12000rpm离心10 min分离得固态产物，洗涤后，将产物重新用去离子水分散，制备成浓度为1mg/ml的透明质酸修饰过氧化钙纳米复合材料的悬液。

21、进一步，所述透明质酸钠、透明质酸和去离子水的用量比为15~20mg：3~5mg：4~5ml。

22、进一步，所述溶液1和氢氧化钠水溶液的体积比为2:0.8~1.2，氯化钙水溶液浓度为0.05~0.15mol/l。

23、进一步，所述溶液2和氢氧化钠水溶液的体积比为3:1.5~2.5，氢氧化钠水溶液的浓度为2~3mol/l。

24、进一步，所述溶液3和过氧化氢溶液体积比为12~13ml：240~250μl，过氧化氢溶液的质量体积浓度为30%。

25、最具体地，一种基于过氧化钙载体的复合载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

26、s1. 透明质酸修饰的过氧化钙纳米材料的制备

27、（1）称取透明质酸钠和透明质酸加入到去离子水中，超声使其充分溶解得溶液1，所述透明质酸钠、透明质酸和去离子水的用量比为15~20mg：3~5mg：4~5ml；

28、（2）向溶液1中加入氯化钙水溶液，室温快速搅拌混匀得溶液2，所述溶液1和氢氧化钠水溶液的体积比为2:0.8~1.2，氯化钙水溶液浓度为0.05~0.15mol/l；

29、（3）向溶液2中加入氢氧化钠水溶液，充分混匀的溶液3，所述溶液2和氢氧化钠水溶液的体积比为3:1.5~2.5，氢氧化钠水溶液的浓度为2~3mol/l；

30、（4）向溶液3中逐滴加入过氧化氢溶液，继续室温快速搅拌得溶液4，所述溶液3和过氧化氢溶液体积比为12~13ml：240~250μl，过氧化氢溶液的质量体积浓度为30%；

31、（5）将乳蓝色溶液4以12000rpm离心10 min分离得固态产物，洗涤后，将产物重新用去离子水分散，制备成浓度为1mg/ml的透明质酸修饰过氧化钙纳米复合材料的悬液；

32、s2. 有效成分的复合

33、（1）pllce6的制备：将n-羟基琥珀酰亚胺酯（nhs）、n,n'-二环己基碳二亚胺（dcc）和ce6溶解于干燥的dmso溶液中，避光室温反应24 h，得ce6-nhs，所述nhs、dcc、ce6和dmso的用量比为2~3mg:2~3mg:1mg:10ml；将n-乙基吗啉（nem）、pll和ce6-nhs溶解于干燥dmso中，避光室温反应24 h后，透析冻干得到产物pllce6，所述nem、pll、ce6-nhs和dmso的用量比为0.8~1.2mg:0.8~1.2mg:5~7mg:10ml；

34、（2）将pllce6配制成1mg/ml的pllce6溶液，滴加到1mg/ml的透明质酸修饰过氧化钙纳米复合材料的悬液中得混合液，然后置于旋转混悬仪上处理10min，pllce6溶液和悬液的体积比为1:1~1.5；

35、（3）将混合液以12000rpm离心10min分离得到负载了pllce6的透明质酸修饰的过氧化钙纳米粒。

36、由于 epr 效应，cao2@ha/pllce6能在感染部位积累。由于 cao2@ha/pllce6 表面带弱正电荷，它能有效地渗透到生物膜中，初步渗透后，大量h2o2在弱酸性和透明质酸酶（had）过表达的细菌生物被膜微环境中迅速释放。释放出的 h2o2一方面在过氧化氢酶的催化下产生 o2，从而缓解生物膜缺氧，增强pllce6 的治疗效果；另一发面通过氧化还原反应消耗过表达的 gsh(谷胱甘肽)，进一步提高 ros 的治疗效率。

37、本发明具有如下技术效果：

38、本发明中通过采用多聚赖氨酸修饰将ce6转化为pllce6，再与透明质酸修饰的过氧化钙纳米粒复合，pllce6均匀负载于其表面，形成了自供氧复合纳米载药粒子cao2@ha/pllce6，解决了ce6无法附着到cao2纳米粒表面的问题，制备的纳米复合粒子粒径均匀，比表面积高，pllce6与cao2@ha复合后，作为一个良好的细菌微环境响应材料，能够改善细菌部位的乏氧情况，增强光动力治疗；另一方面改善了ce6的生物相容性及递送效率，从而在低剂量下取得显著的杀菌效果。