一种复合人源脐带间充质干细胞外泌体及其在制备妊娠纹修复悬液中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种复合人源脐带间充质干细胞外泌体及其在制备妊娠纹修复悬液中的应用。

背景技术：

1、干细胞作为生命科学的前沿，是全球研究的焦点和热点，近年来，随着医学的发展，许多传统的干细胞治疗开发者们开始转向研究干细胞外泌体，干细胞外泌体因其具有增强细胞活力、抑制细胞凋亡、抗炎、抗纤维化（抑制瘢痕产生）、抗氧化作用、促进血管生成和增强基质的完整性等功效被广泛应用于临床各领域。

2、妊娠纹（stretch marks），也称为皮肤条纹或疤痕，是皮肤在快速伸展和收缩过程中形成的一种常见的皮肤问题。它们通常在怀孕期间出现，妊娠纹是一种常见的皮肤问题，特别是在怀孕期间，通常出现在腹部、胸部、臀部和大腿等部位。

3、cn110123838b公开了一种负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备妊娠纹修复或妊娠纹治疗的药物或化妆品中的应用，其利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以起到更好的疾病治疗效果；但其制备过程复杂，难以实现产业化应用。

4、cn110652491b公开了一种具有祛除妊娠纹功效的护肤制品及其制备方法与应用，但虽然具有良好的妊娠纹修复效果，但其成分复杂，且加入了大量的防腐成分以及烟酰胺，可能存在刺激性。

5、鉴于此，提出本技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种复合人源脐带间充质干细胞外泌体及其在制备妊娠纹修复悬液中的应用，所述的复合人源脐带间充质干细胞外泌体具有优异的妊娠纹修复效果，具有广泛的应用前景。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种复合人源脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）将处理好的脐带组织接种于第一培养基中进行培养，待细胞融合度达到80~85%时，加入胰蛋白酶进行消化，再用第一培养基进行传代培养；

5、（2）第三代细胞融合度达到78~82%时，转移至第二培养基进行培养，待细胞融合度达到80~85%时，收集上清液，离心，得到人源脐带间充质干细胞外泌体；

6、（3）将人源脐带间充质干细胞外泌体、马齿苋提取物、角鲨烷、生育酚乙酸酯、甘油混合均匀，得到复合人源脐带间充质干细胞外泌体；

7、所述第一培养基包括以下组分：胎牛血清9~11%、β-巯基乙醇10~40μm、谷胱甘肽80~100μg/ml、天冬氨酸0.01~0.04mm、表皮生长因子10~40ng/ml、亚硒酸钠0.2~0.5μg/l、重组人血白蛋白1~2g/l、茴香霉素0.2~0.4mg/l、左旋肉碱50~60mg/l、d-半乳糖0.1~0.5mg/l、亚麻酸100~200μg/l、余量dmem培养基。

8、本发明创造性的将脐带组织经过第一培养基、第二培养基进行培养，得到所述的人源脐带间充质干细胞外泌体，再将人源脐带间充质干细胞外泌体与马齿苋提取物、角鲨烷、生育酚乙酸酯、甘油进行混合，得到所述的复合人源脐带间充质干细胞外泌体，得到了具有优异的修复妊娠纹效果的复合人源脐带间充质干细胞外泌体，所述的人源脐带间充质干细胞外泌体能够有效的提高妊娠纹部位弹性，减少妊娠纹面积，促进妊娠纹的淡化，减少疤痕。

9、本发明通过优化外泌体的培养条件，有效的提高外泌体的生物活性和对妊娠纹的修复效果，本发明的培养方法能够促进细胞增殖和分化，能够保护外泌体在培养过程中免受环境损伤，提高其稳定性，并提高外泌体的纯度。所述的人源脐带间充质干细胞外泌体含有丰富的生长因子的信号分子以及复杂的活性成分，能够调控皮肤的增殖和胶原蛋白的合成能力，有效的提高皮肤的弹性，有效的提高妊娠纹部位的弹性，促进皮肤新陈代谢，提高皮肤细胞的再生和修复能力，减少胶原纤维断裂和疤痕形成，加速妊娠纹的修复。马齿苋提取物具有抗炎、抗氧化和促进皮肤再生的作用，能够加速妊娠纹区域的修复，马齿苋提取物的加入有助于提高体系的抗氧化应激性能，提高人源脐带间充质干细胞外泌体的稳定性，同时能够抑制角质形成细胞和成纤维细胞的凋亡，马齿苋提取物能够有效的保护皮肤屏障，减少水分散失，增加皮肤的水合率，为人源脐带间充质干细胞外泌体的修复提供一个良好的环境，同时马齿苋提取物具有优异的舒缓性能，能够舒缓妊娠纹部位；所述的人源脐带间充质干细胞外泌体和马齿苋提取物共同作用，在二者的协同作用下，有效的提供了对于妊娠纹的修复效果。

10、需要说明的是，在所述的人源脐带间充质干细胞外泌体制备方法中，本领域技术人员可根据实际情况进行换液（更换培养液）和震荡（促进脐带组织均匀分布）。

11、作为本发明的优选实施方案，所述第二培养基包括以下组分：胎牛血清9~11%、β-巯基乙醇10~ 40μm、谷胱甘肽80~100μg/ml、天冬氨酸0.01~0.04mm、表皮生长因子10~40ng/ml、余量dmem培养基。

12、作为本发明的优选实施方案，所述培养在36.5~37.5℃、5%co2的培养箱中进行。

13、作为本发明的优选实施方案，所述人源脐带间充质干细胞外泌体、马齿苋提取物、角鲨烷、生育酚乙酸酯、甘油的质量比为1：（0.5~2）：（2~5）：（2~5）：（30~50）。

14、作为本发明的优选实施方案，所述马齿苋提取物的制备方法，包括以下步骤：

15、（1）将马齿苋粉进行超临界萃取，得到萃取产物；

16、（2）将萃取产物、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶加入到水中，进行酶解，得到酶解液；

17、（3）先以截留分子量500da的超滤膜超滤，再以截留分子量5000da的超滤膜超滤，干燥，得到马齿苋提取物。

18、本发明的发明人首先是采用了市售的马齿苋提取物，在使用过程中发现，市售的马齿苋提取物具有一定的修复妊娠纹的效果，但效果仍有待提高，这可能与马齿苋的提取方法有关。

19、本发明先将马齿苋进行超临界萃取，而后进行酶解，最后进行两次超滤，截留分子量为500~5000da的有效成分，更加有利于修复妊娠纹，所制备得到的马齿苋提取物能够很好的与人源脐带间充质干细胞外泌体发挥协效作用，提高妊娠纹修复效果。

20、作为本发明的优选实施方案，所述马齿苋粉的粒度为50~400目。

21、作为本发明的优选实施方案，所述超临界萃取以co2为萃取剂，80~90wt%乙醇作为夹带剂，co2流量为70~90ml/min，萃取温度为38~42℃，萃取压力为22~25mpa，萃取时间为55~65min。

22、作为本发明的优选实施方案，所述萃取产物、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、水的质量比为1：（0.01~0.03）：（0.01~0.02）：（0.01~0.02）：（5~12）。

23、作为本发明的优选实施方案，所述酶解温度为45~55℃，酶解时间为3~7h。

24、本发明还提供了一种修复妊娠纹的药物，包括上述所述的复合人源脐带间充质干细胞外泌体；所述药物为妊娠纹修复悬液。

25、本发明所述的复合人源脐带间充质干细胞外泌体可添加辅料和助剂，从而制备成妊娠纹修复悬液。

26、本发明的有益效果在于：本发明将脐带组织经过第一培养基、第二培养基进行培养，得到所述的人源脐带间充质干细胞外泌体，再将人源脐带间充质干细胞外泌体与马齿苋提取物、角鲨烷、生育酚乙酸酯、甘油进行混合，得到所述的复合人源脐带间充质干细胞外泌体，得到了具有优异的修复妊娠纹效果的复合人源脐带间充质干细胞外泌体，所述的人源脐带间充质干细胞外泌体能够有效的提高妊娠纹部位弹性，减少妊娠纹面积，促进妊娠纹的淡化，减少疤痕。