稀释至20L，混匀后湿法上经活化的 直径为50厘米，高1. 5米的D101大孔吸附树脂层析柱中，预吸附12小时后，用浓度为15% 的乙醇以1. 5BV/h的速度洗脱，洗脱体积为50L，收集15 %乙醇洗脱液，浓缩，得大枣大孔吸 附树脂洗脱部位（22L)，备用；
[0039] (4)取步骤（3)得到的大枣大孔吸附树脂洗脱部位湿法上经转型的直径为20厘 米，高1. 5米的732型强酸型阳离子交换树脂柱，用浓度为0. 8 %氨水洗脱，洗脱体积为 50L，收集0. 8 %氨水洗脱液，浓缩，反复脱氨后减压干燥得到精制大枣核苷提取物（164g)。
[0040] 实施例3
[0041] 大枣辅助改善学习记忆能力活性提取物，其通过以下方法制备得到：
[0042] (1)取大枣拣选、洗净、干燥后称取10kg，放入提取罐中，加12倍量的水，加热回流 1次，每次2h，过滤、合并提取液，浓缩，得大枣粗提取物（10. 5L)，备用；
[0043] (2)取步骤（1)得到的大枣粗提物，加乙醇至含醇量85%，静置过夜后取上清液， 减压回收乙醇，得大枣水提醇沉物（8. 5L)，备用；
[0044] (3)取步骤（2)得到的大枣水提醇沉物，加水稀释至20L，混匀后湿法上经活化的 直径为50厘米，高1. 5米的D101大孔吸附树脂层析柱中，用浓度为8%的乙醇以0. 8BV/ h的速度洗脱，洗脱体积为50L，收集8 %乙醇洗脱液，浓缩，得大枣大孔吸附树脂洗脱部位 (18L)，备用；
[0045] (4)取步骤（3)得到的大枣大孔吸附树脂洗脱部位湿法上经转型的直径为20厘 米，高1. 5米的732型强酸型阳离子交换树脂柱，用浓度为1. 2 %氨水洗脱，洗脱体积为 50L，收集1. 2%氨水洗脱液，浓缩，反复脱氨后减压干燥得到精制大枣核苷提取物（155g)。
[0046] 实施例4
[0047] 大枣辅助改善学习记忆能力的实验研宄
[0048] 一、实验材料
[0049] 1 ?供试样品
[0050] 分别取实施例1?3制备得到的精制大枣核苷提取物，加水稀释制成所需浓度。
[0051]2?动物
[0052]SPF级雄性ICR小鼠共240只，体重为18?22g，由浙江省实验动物中心提供，合 格证号SCXK(浙）2008-0033。
[0053] 3.动物饲养
[0054] 实验动物饲养于SPF级动物房，动物房温度范围20-24°C，相对湿度40%?70%。
[0055] 4.实验动物分组及给药方式
[0056] 本实验设计了三个大组，分别用于水迷宫实验、跳台实验、避暗实验。每组40只小 鼠，每大组又分对照组及本发明实施例1制备得到的精制大枣核苷提取物低、中、高3个剂 量组（每组10只），剂量分别为0. 08g/kg/d，0. 16g/kg/d，0. 32g/kg/d(相当于人拟用剂量 的5倍、10倍、20倍），即称取本发明实施例1制备得到的0. 8、1. 6、3. 2g精制大枣核苷提取 物样品，加蒸馏水至200mL分别经口灌胃低、中、高剂量组小鼠，灌胃量为0.2mL/10g，对照 组给予等量蒸馏水，每日一次，连续灌胃30天。
[0057]末次灌胃后次日，分别进行跳台实验、避暗实验和水迷宫实验，并记录相应的指 标。
[0058] 5?仪器
[0059] YLS-3T型跳台仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司），BA-200小鼠避暗仪 (成都泰盟科技有限公司）；M〇rris水迷宫实验系统（包括Morris水迷宫，电脑摄像系统， 配套软件分析系统），由北京中科院生理所生产。
[0060] 二、实验方法
[0061] 1?跳台试验
[0062]末次给药后次日开始训练，训练期间继续给予受试物。将动物放入反应箱内（台 上、台下）适应3min，立即通以36V交流电刺激小鼠。然后将小鼠放在绝缘平台上（计时开 始），记录各鼠第1次跳下平台的潜伏期、5min内每只小鼠受到电击的次数（跳下平台的错 误次数）和各组跳下平台的动物数，以此作为学习成绩。24h后重复测验，将小鼠放在绝缘 平台上（计时开始），记录第2次跳下平台的潜伏期、3min内的跳下平台的错误次数和各组 跳下平台的动物数。停止训练5d后进行消退试验，方法同重测验。
[0063] 2?避暗试验
[0064]末次给后药次日开始训练，训练期间继续给予受试物。实验时将小鼠面部背向洞 口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，去除小 鼠，记录每只鼠从放入明室（计时开始）至进入暗室遭电击所需的时间（潜伏期），5min内 进入暗室的错误次数和各组进入暗室的动物数。24h后同一时间，再进行测验，记录每只鼠 进入暗室的潜伏期、5min内进入暗室的错误次数和各组进入暗室的动物数。停止训练5d后 进行消退试验。
[0065] 3?水迷宫试验
[0066]末次给后药次日开始训练，训练期间继续给予受试物。每天训练1次，连续5d。 第1天训练时将小鼠放在梯子附近，使其自动爬上3次，以后每次训练前将小鼠放在梯子附 近，使其自动爬上1次。第1天训练时，用挡板在A处挡死，从A点开始进行训练；第2天从 B处开始，此路程训练3d，至80%的动物在2min内到达终点；第5天从起点开始训练；最后 以5d的总学习成绩进行评价（即各组5d到达终点的总时间、总错误次数和各组2min内到 达终点的动物数）。停止训练5d后进行消退试验。
[0067]4?数据统计
[0068] 采用SPSS18. 0统计软件，数据以x±s表示，组间比较采用t检验，P〈0. 05为有 统计意义。
[0069] 5?结果判定
[0070] 跳台实验中的潜伏期、错误次数和3min内跳下平台的动物数中的任意一项为阳 性，均可判定该项实验阳性。避暗实验中的潜伏期、5min内进入暗室的次数和5min内进入 暗室的动物数中的任意一项为阳性，均可判定该项实验阳性。水迷宫实验中，到达终点的时 间、错误次数和到达终点的动物数中任意指标为阳性，可判为该项实验阳性。水迷宫实验、 跳台实验及避暗实验三项实验中任二项实验结果阳性，且重复实验结果一致（所重复的同 一实验两次结果均为阳性），可以判定该精制大枣核苷提取物辅助改善记忆功能动物实验 结果阳性。
[0071] 三、实验结果
[0072] 1.精制大枣核苷提取物对小鼠跳台学习记忆成绩的影响
[0073] 第一次实验：由表1可见，各剂量组小鼠训练时及测验时跳下平台的潜伏期、错误 次数与对照组比较，差异无显著性（P>〇. 05);各剂量组小鼠测验时跳下平台的动物数与对 照组比较，差异无显著性（P>〇. 05)。
[0074] 表1精制大枣核苷提取物对小鼠跳台实验学习记忆成绩的影响（X土s)
[0075]
【主权项】
1. 一种精制大枣核苷提取物，其特征在于，通过以下步骤制备得到： (1) 取大枣拣选、洗净、干燥后放入提取罐中，加6~12倍量的水或0%~50%乙醇，加热回 流1~3次，过滤、合并提取液，浓缩，得大枣粗提物，备用； (2) 取步骤（1)得到的精制大枣核苷提取物，加乙醇至含醇量40%~90%，静置过夜后取 上清液，减压回收乙醇，得大枣水提醇沉物，备用； (3) 取步骤（2)得到的大枣水提醇沉物，加水稀释后，湿法上大孔吸附树脂柱，用浓度 为5%~50%的乙醇洗脱，收集5%~50%乙醇洗脱液、浓缩，得大枣大孔吸附树脂洗脱物，备用； (4) 取步骤（3)得到的大枣大孔吸附树脂洗脱物湿法上离子交换树脂柱，先用水洗 脱，再用浓度为〇. 5%?5%的氨水洗脱，并收集0. 5%?5%的氨水洗脱液，浓缩，反复脱氨后 减压干燥得到精制大枣核苷提取物。
2. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（1)中提取条件为加 10倍量水，加热至沸后持续回流2小时。
3. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（2)中所述的加乙醇 至含醇量80%。
4. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（3)中所述的大孔吸 附树脂为非极性大孔吸附树脂。
5. 根据权利要求4所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（3)中所述的非极性 大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂。
6. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（3)中所述的收集的 洗脱液为体积浓度10%乙醇，收集洗脱液量为2~5个柱体积。
7. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（4)中精制大枣核苷 提取物包括重量百分比5%以上的环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷和环磷酸尿苷成分。
8. 根据权利要求1所述的精制大枣核苷提取物，其特征在于，步骤（4)中所述的收集的 洗脱液为体积浓度1%氨水，收集洗脱液量为2~5个柱体积。
9. 权利要求1所述的精制大枣核苷提取物在制备辅助改善学习记忆功能药物或保健 品中的应用。
10. 根据权利要求9所述的精制大枣核苷提取物在制备辅助改善学习记忆功能药物或 保健品中的应用，其特征在于，将精制大枣核苷提取物和药学上可接受的载体制成颗粒剂、 胶囊剂、片剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物或 保健食品。
【专利摘要】本发明公开了一种大枣活性提取物及其在制备辅助改善记忆功能药物或保健品中的应用。本发明首次采用大孔吸附树脂耦合离子交换树脂，制备大枣精制提取物，较传统的分离纯化方法分离效率更高，且分离得到的活性成分含量高，生物活性强，安全性高。小鼠避暗实验结果显示，精制大枣核苷提取物可显著延长小鼠进入暗室的潜伏期，降低小组进入暗室的错误次数；小鼠水迷宫实验结果显示，精制大枣核苷提取物可显著缩短小鼠到达终点的时间。表明精制大枣核苷提取物具有改善小鼠学习记忆功能的功效。因此，大枣有望开发成为新一代安全有效，用于辅助改善学习记忆功能的药物或保健品，同时也为大枣的深加工产业化开发提供了途径。
【IPC分类】A61K31-7072, A61K31-708, A23L1-30, A61P25-28, A61K36-725, A61K31-7076
【公开号】CN104523875
【申请号】CN201410750558
【发明人】郭盛, 段金廒, 钱大玮, 宿树兰
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月9日