用于诊断和治疗癌症以及自身免疫病的单克隆抗体的制作方法
【专利说明】用于诊断和治疗癌症以及自身免疫病的单克隆抗体
[0001] 本申请要求于2012年7月10日提交的美国临时申请序列号61/669, 967和于2012 年9月19日提交的美国临时申请序列号61/702, 916的优先权，这两个申请的全部内容通 过引用并入本文。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明在国家癌症研究所/国立卫生研究院授予的P50CA100632的政府支持下 完成。政府享有本发明的某些权利。
[0004] 1.技术领域
[0005] 本发明一般性地涉及癌症和免疫疗法的领域。更特别地，其涉及用于治疗和预防 癌症以及自身免疫病的免疫诊断和免疫治疗抗体。
[0006] 2.【背景技术】
[0007] 免疫系统长期以来参与癌症控制；然而仍缺少关于人癌症中特异且有效的免疫应 答的证据。在慢性骨髓性粒细胞白血病（chronicmyelogenousleukemia，CML)中，异体骨 髓移植（BMT)或干扰素-a2b(IFN-a2b)疗法已经产生了完全缓解，但是疾病控制的机制 还不知道并且可涉及免疫抗白血病应答。
[0008] 基于本领域中的证据，认为淋巴细胞在介导抗白血病效应中发挥着作用。研究表 明，异体供体淋巴细胞输注OLI)已经用来治疗异体BMT后的髓性白血病复发（Giralt和 Kolb，1996;Kolb和Holler，1997;Kolb等，1995;Kolb等，1996 ;Antin，1993)。在约 70 % 至80%的处于慢性期（CP)的慢性髓细胞白血病（CML)患者中，来自原始骨髓（BM)供体的 淋巴细胞输入诱导了血液学应答和细胞遗传学应答二者（Kolb等，1996 ;Kolb和Holler， 1997)。对于AML，DLI后的缓解一般不如慢性期CML中所获得的缓解那么持久，这可反映 出肿瘤生长超过形成免疫应答之动力学的快速动力学。另外，大多数有骨髓形式白血病的 患者将死于该疾病，除非他们可通过异体骨髓移植进行治疗，其中相关的移植物抗白血病 (graftversusleukemia,GVL)效应治愈患者。然而，移植物抗宿主病（GVHD)和移植相关 毒性限制了该治疗。认为GVL可与GHVD分开，并且靶向针对白血病相关抗原的免疫应答将 允许GVL向患者转移而无GVHD。
[0009] 因此，如果可确定更多的抗原（即，白血病抗原或针对其他癌症的抗原），并且如 果可获得大量最有效的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，则将允许开发白血病特异 性疗法、乳腺癌特异性疗法等，使用抗原作为靶标用于疫苗或用于产生用于过继免疫疗法 的特异性T细胞。
[0010]PR1(来源于蛋白酶3(P3)和弹性蛋白酶的HLAA2. 1限制性九聚物）被鉴定为 白血病相关抗原（Molldrem等，2000;Molldrem等，1996;Molldrem等，1997;Molldrem 等，1999 ;Molldrem等，2003,各自以其整体通过引用并入本文）。Burchert等（2002)和 Scheibenbogen等（2002)已经独立地证实了PR1是白血病相关抗原的发现。对PR1特异的 CTL杀伤AML、CML和MDS细胞，但是不杀伤正常骨髓细胞。在最近的I/II期疫苗研究中， 向八1^、01^和1?5患者施用？1?1肽，并且在47%的患者中引发了？1?1特异性(：11免疫，而 在26%的患者中观察到临床应答。因此，该抗原为进一步研究抗癌免疫应答以及开发新治 疗剂提供了有趣的平台。
【发明内容】
[0011] 因此，根据本发明，提供了分离并纯化的抗体，其在被HLA-A2受体结合时与 VLQELNVTV(SEQIDN0:45)结合，所述抗体具有包含SEQIDN0:3、4和5的重链CDR以及 包含SEQIDN0 :8、9和10的轻链CDR。抗体可以是小鼠抗体、单链抗体、双特异性抗体、与 非抗体肽或多肽区段融合的，与诊断试剂（例如，荧光团、发色团、染料、放射性同位素、化 学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂（spin-trappingreagent))连接的、与治疗试剂 (例如，细胞因子、化学治疗剂、放射治疗剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子 或免疫共刺激分子）连接的、人源化抗体或以上的组合。除了对SEQIDN0 :45的结合亲和 力之外，双特异性抗体还可具有对B细胞（⑶19、⑶20)、NK细胞、吞噬细胞（⑶16)或单核细 胞（⑶14)的结合亲和力。特别的人源化抗体可具有SEQIDN0 :38和36或者SEQIDN0 : 40和36以及SEQIDNO:40和42的轻链/重链序列。
[0012]在另一个实施方案中，提供了编码由SEQIDN0 :8、9和10编码之轻链⑶R的核 酸。所述核酸可编码SEQIDN0:7或SEQIDN0:12,或者可编码SEQIDN0:23或SEQID NO:25。所述核酸还可包含位于编码轻链⑶R之核酸5'的启动子序列，例如，在真核细胞或 原核细胞中具有活性的启动子序列。所述核酸可位于可复制载体（例如非病毒载体或病毒 载体）中。所述核酸还可包含接头编码区段，其中所述接头编码区段位于所述CDR编码区 段之间，例如编码螺旋-转角-螺旋基序的区段。
[0013] 在又一个实施方案中，提供了这样的人工抗体：其包含重链编码区段和轻链编码 区段，所述重链编码区段包含含有SEQIDN0 :3、4和5序列的CDR;所述轻链编码区段包含 含有SEQIDN0 :8、9和10序列的⑶R。⑶R可通过合成接头连接。重链可与非抗体肽或 多肽区段融合。抗体可与诊断试剂（例如荧光团、发色团、染料、放射性同位素、化学发光分 子、顺磁性离子或自旋捕获试剂）连接。抗体可与治疗试剂（例如细胞因子、毒素、化学治 疗剂、放射治疗剂、激素、抗体Fc片段、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3、TLR激动剂、含 CpG的分子或免疫共刺激分子）连接。轻链可包含SEQIDN0:7、SEQIDN0:12、SEQID NO:23 或SEQIDNO:25,和 / 或重链包含SEQIDNO:36 或SEQIDNO:42。
[0014] 在再一个实施方案中，提供了制备抗体的方法，其包括：(a)将（i)编码包含SEQ IDNO:3、4和5所示⑶R之重链的核酸序列及（ii)编码包含SEQIDNO:8、9和10所示 CDR之轻链的核酸序列引入宿主细胞中；以及（b)在支持所述轻链和重链表达的条件下培 养所述宿主细胞。所述方法还可包括分离所述抗体。所述方法还可包括使所述抗体与诊断 剂或治疗剂连接的步骤。
[0015] 在另一个实施方案中，提供了在怀疑含有异常细胞的样品中检测异常细胞的方 法，其包括使所述样品与如上所述的抗体或人工抗体相接触。所述抗体或人工抗体可与诊 断剂（例如，荧光团、发色团、染料、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获 试剂）缀合。所述抗体或人工抗体可使用第二结合剂（secondarybindingagent)(例如抗 Fc受体抗体）进行检测。所述样品可以是（a)来自头颈部、脑、食管、乳腺、肺、肝、脾、胃、小 肠、大肠、直肠、卵巢、子宫、宫颈、前列腺、睾丸或皮肤组织的肿瘤组织，或者（b)流体如血 液、淋巴、尿、骨髓抽吸液（aspirate)或乳头抽吸液。所述样品可来自于经切除的肿瘤床。 所述方法还可包括基于检测的存在、不存在或程度作出治疗决定，例如用基于PR-1的肽疫 苗治疗所述对象的决定。所述方法可检测原发性癌细胞、转移癌细胞或骨髓发育异常细胞 (myeloid dysplastic cell)〇
[0016] 在又一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施 用如上所述的抗体或人工抗体。所述抗体或人工抗体可与治疗剂缀合。所述癌症可为实体 瘤，例如头颈部肿瘤、脑肿瘤、食管肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、脾肿瘤和胃肿瘤、小肠 肿瘤、大肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、宫颈肿瘤、前列腺肿瘤、睾丸肿瘤或皮肤肿 瘤。所述癌症可为血癌，例如白血病或淋巴瘤。所述治疗剂可为细胞因子、毒素、化学治疗 齐IJ、放射治疗剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。所述方 法还可包括向所述对象提供第二抗癌治疗（secondanticancertherapy),例如基因治疗、 化学治疗、放射治疗、激素治疗、毒素治疗或手术。所述抗体或人工抗体可向所述对象施用 多于一次。所述癌症可为复发癌或转移癌。所述抗体可向所述对象施用多于一次。
[0017] 在再一个实施方案中，提供了治疗患有自身免疫病的对象的方法，其包括向所述 对象施用如上所述的抗体或人工抗体。所述自身免疫病可为韦格纳肉芽肿病（Wegener's granulomatosis)、丘-斯综合征（Churg-StraussSyndrome)或系统性小血管炎（systemic smallvesselvasculitis)。所述抗体或人工抗体可与治疗剂（例如毒素或凋亡诱导剂） 缀合。所述方法还可包括向所述对象提供第二抗自身免疫治疗。所述第二抗自身免疫治疗 可为抗炎剂。所述抗体可向所述对象施用多于一次。
[0018] 还提供了诱导HLA-A2癌细胞之补体介导的细胞毒性的方法，其包括使所述癌细 胞与如上所述的抗体或人工抗体相接触。
[0019] 本发明的另一个实施方案提供了在怀疑含有异常细胞的样品中检测异常细胞的 方法，其包括使所述样品与如上所述的抗体或人工抗体相接触。所述抗体或人工抗体可与 诊断剂（例如荧光团、发色团、染料、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获 试剂）缀合。可使用第二结合剂（例如抗Fc受体抗体）检测所述抗体或人工抗体。所述 样品可以是（a)来自头颈部、脑、食管、乳腺、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、直肠、卵巢、子宫、宫 颈、前列腺、睾丸或皮肤组织的肿瘤组织，或者（b)流体如血液、淋巴、尿、骨髓抽吸液或乳 头抽吸液。所述样品可来自于经切除的肿瘤床（tumorbed)。所述方法还可包括基于检测 的存在、不存在或程度作出治疗决定，例如用基于PR-1的肽疫苗治疗所述对象的决定。
[0020] 所述方法可检测原发性癌细胞、转移癌细胞或骨髓发育异常细胞。
[0021] 在再一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施 用如上所述的抗体或人工抗体。所述抗体或人工抗体可与治疗剂（例如细胞因子、毒素、化 学治疗剂、放射治疗剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子） 缀合。所述癌症可为实体瘤，例如头颈部肿瘤、脑肿瘤、食管肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿 瘤、脾肿瘤和胃肿瘤、小肠肿瘤、大肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、宫颈肿瘤、前列 腺肿瘤、睾丸肿瘤或皮肤肿瘤。或者，所述癌症可为血癌，例如白血病或淋巴瘤。所述癌症 可为复发癌或转移癌。所述方法还可包括向所述对象提供第二抗癌治疗，例如基因治疗、化 学治疗、放射治疗、激素治疗、毒素治疗或手术。所述抗体或人工抗体可向所述对象施用多 于一次。
[0022] 在再一个实施方案中，提供了治疗患有自身免疫病的对象的方法，其包括向所述 对象施用如上所述的抗体或人工抗体。所述自身免疫病可为韦格纳肉芽肿病、丘-斯综合 征或系统性小血管炎。所述抗体或人工抗体可与治疗剂（例如毒素或凋亡诱导剂）缀合。 所述方法还可包括向所述对象提供第二抗自身免疫治疗，例如抗炎剂。所述抗体可向所述 对象施用多于一次。
[0023] 另外的方法包括：（i)治疗患有骨髓发育异常疾病的对象，其包括向所述患者施 用如上所述的抗体或人工抗体；以及（ii)诱导HLA-A2癌细胞之补体介导的细胞毒性，其包 括使所述癌细胞与如上所述的抗体或人工抗体相接触。
[0024]Hul-8F4和Hu2-8F4分别是指Hu8F4-l和Hu8F4