格雷伊拉德科菲耶提取物及其应用
【专利说明】格雷伊拉德科菲耶提取物及其应用
[0001]引言和发明背景
[0002]本发明涉及植物提取物的分离和植物提取物在治疗皮肤色素沉着中的应用。尤其是，本发明涉及从格雷伊拉德科菲耶(Greyia radlkoferi，G.radlkoferi)植物的植物材料中分离酪氨酸酶抑制剂。
[0003]皮肤色素沉着是由黑色素过量引起的病情，色素存在于约10%的黑色素细胞中。由于在生物合成途径中黑色素生物合成受到负责催化速率限制步骤的酪氨酸酶的控制，含有称为“酪氨酸酶”的单加氧酶的铜是黑色素合成中的关键酶。酪氨酸酶的过度活性导致黑色素的过度产生，最终导致皮肤色素沉着。皮肤的色素沉着可以归因于过度暴露于UV光和药物不良反应，同时衰老过程中也会发生皮肤的色素沉着。
[0004]因此，为了治疗皮肤色素沉着，公知的目标是抑制酪氨酸酶。许多已知的用于治疗皮肤色素沉着的产品具有毒性和其它副作用。这些已知的产品含有例如对苯二酚、曲酸、熊果苷、光甘草定和异甘草素等的药剂。一些化妆品含有对人类表现出具有细胞毒性和诱变性的药剂。这些已知的皮肤色素沉着的治疗手段除了细胞毒性和诱变性之外，已经知道，其也导致如下文详细阐述的特定的和不希望的副作用。
[0005]在医学研宄和文献中已基本确认对苯二酚作为抑制黑色素生成的主要外用成分。这种成分已知会引起皮肤刺激，而且存在认为具有致癌性的恐惧心理。随着对非处方药销售的关注，在欧盟的成员国内对苯二酚已经相应地被禁止用作皮肤美白剂，且在美国范围内由FDA监管。
[0006]公知地，曲酸是日本米酒或清酒生产中从大米发酵而得到的副产物。它已被吹捧为黑色素生成的有效抑制剂，并且已被广泛认为是在皮肤色素沉着治疗中显示出的最有效的纯产品之一。然而，因为某些研宄表明曲酸可能是致癌的，而且它随后在韩国和日本被禁止用于化妆品，在皮肤色素沉着的治疗中使用曲酸已经越来越有争议。除了提到的曲酸潜在致癌性之外，还发现曲酸是刺激性接触性皮炎的潜在原因；是引起过敏症的；具有高致敏可能性；和高频率的接触易感性。还发现曲酸一经暴露于阳光和周围空气中就变色至棕色，这也导致了效率降低。也有人建议将曲酸二棕榈酸酯作为曲酸的替代品以克服与曲酸相关的缺点，但试验显示，曲酸二棕榈酸酯不具有与曲酸相同的效果。
[0007]在皮肤色素沉着的治疗中公开的另一种已知化合物是熊果苷，它是来自不同的浆果植物，包括桑椹、蔓越莓和蓝莓。它展现出具有皮肤美白性能，但也会对皮肤造成刺激。
[0008]从甘草(光果甘草)中提取的光甘草定和异甘草素已被发现表现出皮肤美白性能，但二者不能有效地渗入皮肤，且在作为配方使用时二者都是不稳定的。
[0009]发明目的
[0010]相应地本发明的目的是提供一种酪氨酸酶抑制剂，可以至少部分地克服上述经已知的酪氨酸酶抑制剂和其它皮肤色素沉着治疗手段的缺陷，或者是相对已知的酪氨酸酶抑制来说以成本划算的方式提供一种更为有用的、环保的、有机替代物。
【发明内容】
[0011]根据本发明的第一个方面，提出了一种用于治疗皮肤色素沉着的具有酪氨酸酶抑制活性的植物提取物的制备方法所述方法包括如下步骤:
[0012]-将格雷伊拉德科菲耶(G.radlkoferi)的叶子干燥；
[0013]-粉碎干燥的叶子；
[0014]-将粉碎的叶子与溶剂混合以允许酚类化合物渗入所述溶剂中；和
[0015]-将粉碎的叶子从所述溶剂中去除，将植物提取物保留在溶剂中。
[0016]进一步的根据本发明，所述溶剂选自由水和乙醇组成的群组。
[0017]所述将粉碎的叶子与溶剂混合的步骤可以包括:进一步搅拌混合物，以提高酚类化合物从所述叶子向所述溶剂的浸出。
[0018]将粉碎的叶子从所述溶剂中去除的步骤可以包括:使所述溶剂通过真空过滤系统。
[0019]进一步地，根据本发明的方法包括:向植物提取物中添加防腐剂的步骤。优选的，所述防腐剂是苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物，其按照I %的重量百分比加入到所述植物提取物中。
[0020]进一步地，根据本发明的方法包括进一步的步骤:将所述植物提取物制备成外用剂型，所述外用剂型选自由霜剂、洗剂、水剂、膏剂、防晒剂、皮肤油剂和软膏组成的群组。
[0021]根据本发明的第二个方面，提出了一种通过抑制酪氨酸酶活性来治疗皮肤色素沉着的植物提取物，所述植物提取物根据本发明第一方面的方法制备而来，其中，所述提取物包括 5, 7- 二轻基黄酮(5, 7-dihidroxyf lavone) [ (2S)-松属素][(2S) -pinocembrin]；2’ , 6’ - 二轻基-4’ -甲氧基二氢查尔酮(2，，6’-dihydroxy-4’-methoxydihydrochalcone)；2，，4，，6，-三氢甲氧基查尔酮(2，，4’，6’ -trihydroxyhydrochalcone) ；3, 5, 7_ 三轻基黄酮(3, 5, 7-trihydroxyf lavone)和 4’，5’，7 三轻基异黄酮(4，, 5’ , 7-trihydorxyisof Iavone) ο
[0022]进一步地，根据本发明，在使用L-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸(DOPA)作为基质时，所述植物提取物通过介于17.96 μ g/ml至32.62 μ g/ml范围间的50%的抑制浓度(IC5tl)显示出酪氨酸酶抑制活性。
[0023]根据本发明的第三个方面，提出了根据本发明的第一方面和第二方面的植物提取物的应用，所述植物提取物可以制备成外用剂型，以在患有皮肤色素沉着的患者的治疗方法中应用。
[0024]根据本发明的第四个方面，提出了一种用于治疗皮肤色素沉着的外用剂型，所述外用剂型选自由霜剂、洗剂、水剂、膏剂、防晒剂、皮肤油剂和软膏组成的群组中的任何一个，其包含在合适的皮肤病学可接受的载体中的根据本发明的第二方面的植物提取物。
[0025]优选实施方式
[0026]下面将参照非限制性的示例对本发明的优选实施方式进行更详细地描述。
[0027]根据本发明的一个优选实施方式，具有用于治疗皮肤色素沉着的酪氨酸酶抑制剂活性的植物提取物的制备方法包括以下步骤:
[0028]-在避免暴露于阳光的室温下风干格雷伊拉德科菲耶的叶子；
[0029]-粉碎干燥的叶子；
[0030]-使25g粉碎的叶子与200ml溶剂混合中以形成混合物；
[0031]-摇晃所述混合物48小时，以允许酚类化合物渗入溶剂中；和
[0032]-通过使用布氏漏斗真空过滤将粉碎的叶子从溶剂中去除，以形成植物提取物。
[0033]用于与粉碎的叶子混合的溶剂优选为70%浓度的乙醇。去离子蒸馏水可用作乙醇的替代溶剂，以提供有机提取物。
[0034]通过将苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物的防腐剂按照I %重量百分比的形式加入到植物提取物中来保存植物提取物，然后储存于4°C的冷藏室。防腐剂挑战试验表明，加入到提取物中的防腐剂成功抑制了某些微生物(包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌、白色念珠菌和曲霉菌)的生长。
[0035]为了确定植物提取物的化合物组成，对植物提取物进行生物测定引导分馏。在这种情况下，将约59.5g植物提取物溶解在最小量的丙酮溶剂中并与硅胶混合。然后将混合物放置干燥，直到形成细粉末。然后，用己烷(Hex):乙酸乙酯(EtOAc)的增强极性的混合物(100:0Hex至O:1OOEtOAc)在硅胶柱上用色谱法分析该细粉末。收集到约500ml共40种初级馏分。然后，用2升的100%的甲醇(MeOH)洗涤色谱柱。接着用转子蒸气(rotor vapour)浓缩初级饱分并点样于薄层色谱(TLC)板，该薄层色谱板用二氯甲烧:甲醇(DCM = MeOH) 95:5展开，在UV光下观察，并浸在香草醛溶液(7.5克香草醛、250ml乙醇和5ml 98%的浓硫酸(H2SO4