治疗性hbv微环dna疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和DNA疫苗制备领域，具体地说，涉及一种治疗性HBV微环 DNA疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)在全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性和重型肝炎， 并与肝硬化、肝癌的发病密切相关，是严重危害人类健康的感染性疾病。目前全球约有3. 5 亿慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亚太地区，我国的慢性无症状感染者超过 1. 2亿，且慢性乙型肝炎预后不良。目前的抗病毒药物主要是核苷类似物和重组干扰素类药 物，但效果不十分理想。因此，急需一种更有效的治疗药物，清除肝细胞的cccDNA病毒，使 患者痊愈。
[0003] DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达载体的质粒，可直接注射到动物体内 的第三代疫苗。由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原递呈途径被 DC细胞提呈，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T细胞，因此特别有利于诱导Thl型免疫应答，打破 慢性乙肝患者的免疫耐受状态，清除病毒，使患者痊愈。
[0004] 基因载体的选择对DNA疫苗的构建至关重要，一方面，标准质粒的骨架DNA成分均 包括DNA复制起始位点、抗菌素抵抗基因等，这些成分会抑制目的基因表达，并且载体基因 DNA可能插入宿主基因组，诱发插入突变和基因沉默的危险；另一方面，标准质粒转导效率 低，目的基因只能实现瞬间表达，其分子量较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。因此， 安全高效的表达是研宄核酸DNA疫苗基因治疗的关键。
[0005] Chen 等（Mar A.Kay,Cheng-Yi He,Zhi-Ying Chen.A robust systemfor production of minicircle DNA vectors. Nature Biotechnology, (2010). doi:10. 1038/ nbt. 1708)开发的微环DNA载体（MC)技术和微环生成菌株大肠杆菌ZYCY10P3S2T有助于解 决以上问题。MC是一种环状表达盒子，不含标准质粒中细菌骨架DNA，能在体内长期表达高 水平的目的基因产物。MC在结构、基因表达的持久性和细胞内稳定性等方面与共价键密闭 环状DNA (cccDNA)相同，使MC成为安全、高效的理想载体之一。微环DNA的制备方法是将含 目的基因的亲本质粒（PP)转化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖诱导重组酶的表达， 重组酶介导其识别位点发生重组，使PP重组形成含细菌骨架的微质粒（miniplasmid，MP) 和含目的基因表达盒的微环（minicircl e，MC)DNA。通过宿主菌体内联合表达I-SceI内切 酶，将MP和PP质粒酶切，使之成为线性DNA，继而在宿主菌内降解，通过常规质粒分离方法 即可获得高纯度的微环DNA。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种新型的治疗性HBV微环DNA疫苗。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述微环DNA疫苗的制备方法。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的一种治疗性HBV微环DNA疫苗，所述疫苗包括双质 粒，即含有编码HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微环DNA质粒以及含有编码hIL2-IFNy融 合蛋白基因的微环DNA质粒。所述双质粒中均不含有原核质粒的复制元件和抗菌素元件。
[0009] 上述疫苗的制备方法包括以下步骤：
[0010] 1)分别以质粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFNy/pcDNA3. 1 为模板，设计引物，进 行PCR扩增，得到目的片段；
[0011] 2)用BglII和Sail同时双酶切目的片段和ZY781载体，回收，连接，将目的片段 分别克隆至载体ZY781的多克隆位点上，即得亲本质粒preS2. S/ZY781和hIL2-IFNy/ ZY781 ；
[0012] 3)分别用上述亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T，过夜培养，质粒酶切及测序 验证插入正确的片段；
[0013] 4)按0· 25%。的接种量分别将上述菌液接入含kana的TB培养液中，37°C，250rpm 过夜培养，取过夜培养的菌液与Minicle Induction Mix按等体积混合，于32°C，250rpm反 应5-8h，反应结束后，离心提质粒，即得含有编码HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微环DNA 质粒pMCS2. S，以及含有编码hIL2-IFNy融合蛋白基因的微环DNA质粒pMCIIF ;
[0014] 5)分别对含有上述质粒pMCS2. S和质粒pMCI IF的阳性克隆进行菌株发酵培养，发 酵结束后，离心提质粒，纯化。
[0015] 其中，步骤1)中所述引物包括：
[0016] 上游引物 5' -GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3' 和
[0017] 下游引物 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 ' ；
[0018] 步骤4)中所述Minicle Induction Mix的制备方法为：向100ml L B中加入IM NaOH 4ml和20 %阿拉伯糖200 μ 1，混合后经0. 22 μ m滤膜过滤。
[0019] 本发明还提供含有所述疫苗的用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物。
[0020] 本发明还提供所述疫苗在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。
[0021] 本发明提供的治疗性HBV微环DNA疫苗，包括含有编码HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微环DNA质粒pMCS2. S以及含有编码hIL2-IFNy融合蛋白基因的微环DNA质粒 pMCIIF。质粒pMCS2. S和pMCIIF中均不含原核质粒的复制元件和抗菌素元件，可游离于宿 主细胞基因组DNA之外稳定持久地表达外源目的基因，成功实现了在C0S-7细胞中表达外 源基因，诱导Balb/c小鼠产生针对乙型肝炎病毒的高水平IFN γ的Thl型免疫应答和特异 性杀伤应答。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明微环DNA质粒生成示意图。
[0023] 图2为本发明微环DNA质粒pMCS2. S和pMCIIF构建流程图。
[0024] 图3为本发明质粒及质粒酶切后的电泳结果；其中，l.DL2000marker ;2. ZY781 空载体；3. pMCS2. S 质粒；4. preS2. S/ZY781 质粒；5. pMCS2. S 质粒双酶切后；6. preS2. S/ ZY781质粒双酶切后；7. pMCIIF质粒；8. hIL2-IFN γ/ZY781质粒；9. pMCIIF质粒双酶切后； 10.hIL2-IFNy//ZY781 质粒双酶切后。
[0025] 图4为本发明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1质粒转染C0S-7细胞后IL2的表 达量。
[0026] 图5为本发明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1质粒转染COS-7细胞后IFNy的 表达量。
[0027] 图6为本发明实施例3中各实验组ELISPOT斑点直观示意图；其中，a.生理 盐水对照组；b. PHA阳性对照组；c. pcDNA3. l/preS2. S质粒实验组；d pcDNA3. l/preS2. S+pcDNA3. l/hIL2-IFNy 双质粒实验组；e. pMCS2. S微环质粒实验组；f. pMCS2. S+pMCIIF双 微环质粒实验组。
[0028] 图7为本发明实施例3中各实验组ELISPOT斑点统计结果。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0030] 实施例1治疗性HBV微环DNA疫苗的制备
[0031] 包括以下步骤：
[0032] 1.弓丨物设计和PCR扩增目的片段
[0033] 基于重组质粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFN γ /pcDNA3. 1 (构建方法见：何 晓嫱，陈光明，黄英，等.治疗性双质粒HBV DNA疫苗的构建和鉴定.解放军医学杂 志，2003, 28(6) :493-498)的序列，在目的基因的增强子上游和polyA下游设计引物，用于 扩增含有目的基因及其上下游的增强子、启动子和polyA调控序列的DNA片段。设计的引 物序列如下：
[0034] F: 5，-GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3 '
[0035] R: 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 '
[0036] 分别以质粒 preS2. S/pcDNA