[0058] 第一歩，将脱细胞心脏瓣膜和含有原花青素的溶液混合、进行交联，得到脱细胞心 脏瓣膜材料a;
[0059] 第二步，将脱细胞心脏瓣膜材料a和戊二醛溶液混合、进行交联，得到共交联的脱 细胞心脏瓣膜材料；
[0060] 第三步，将共交联的脱细胞心脏瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心 脏瓣膜材料。
[0061] 在本发明的一种实施方式中，上述第一歩和第二步使用的含有原花青素的溶液和 戊二醛溶液是在根据浓度要求分别取用用D-Hanks溶液（pH7. 4)配置成的lOmg/ml的PC原 液，和用D-Hanks溶液（pH7. 4)配置成的0. 625%的GA原液。其中第一歩中使用的含有原 花青素的溶液，以其总体积计，其中原花青素的浓度为6-8mg/ml;第二步中使用的戊二醛 溶液，以其总体积计，其中戊二醛的浓度为〇. 1-0. 25%。
[0062] 为了便于说明问题和进行实验，在本发明的一些实施例中，上述第一歩和第二 步中使用的含有原花青素的溶液(简称PC溶液）和戊二醛溶液(简称GA溶液）的交联浓 度范围分别为 6mg/mL<PC< 10111g/mL(例如但不限于 6、6. 5、7、7. 5、7. 8 和 8mg/mL)， 0? 1%￡GA逆? 25% (例如但不限于 0? 22%、0. 20%、0. 18%、0. 15%、0. 125% 和 0? 10%);PC和GA浓 度在此范围内按PC浓度自6mg/mL递升且GA浓度自0. 25%递减，即它们的组合按下述组成 取用：P2G5 为 2mg/mLPC+0. 5%GA;P4G4 为 4mg/mLPC+0. 37%GA;P5G3 为 5mg/mLPC+0. 32%GA; P6G2 为 6mg/mLPC+0. 25%GA;P8G1 为 8mg/mLPC+0. 125%GA。
[0063] 在本发明的一个优选例中，上述第一歩和第二步中涉及的交联反应条件为 10-42°C(更佳地为25-42°C，最佳地为35-38°C)，60-240转/分钟(更佳地为100-200转/ 分钟，最佳地为120-150转/分钟）摇动交联。
[0064] 在本发明的一个优选例中，上述第一步中涉及的交联反应时间为1-96小时，更佳 地为10-72小时，最佳地为24小时。
[0065] 在本发明的一个优选例中，上述第一歩中脱细胞心脏瓣膜和含有原花青素的溶液 混合吋，以每片（因屠宰场宰杀的成年猪主动脉心脏瓣膜一般大小3. 0-3. 5_X1. 5-2. 0_， 厚薄基本一致）瓣膜加2mL的PC溶液。
[0066] 在本发明的一个优选例中，上述第二步中涉及的脱细胞心脏瓣膜材料a在第一歩 结束后经过D-Hanks溶液清洗了1-5次，较佳地为2-4次，更佳地为3次。
[0067] 在本发明的一个优选例中，上述第二步中涉及的交联反应时间为1-24小时，更佳 地为12-24小时，最佳地为12小时。
[0068] 在本发明的一个优选例中，上述第二步中脱细胞心脏瓣膜材料a和戊二醛溶液混 合吋，以每片（因屠宰场宰杀的成年猪主动脉心脏瓣膜一般大小3. 0-3. 5mmXI. 5-2.Omm， 厚薄基本一致）瓣膜加2mL的GA溶液。
[0069] 在本发明的一个优选例中，上述第三步中所述的混合温度为1-6 °C，最佳地为 4°C.
[0070] 在本发明的一个优选例中，上述第三步中所述的混合时间为15-40天，更佳地为 25-35天，最佳地为30天。
[0071] 用途
[0072] 本发明提供的人工生物心脏瓣膜材料可以用作心脏瓣膜或用于制备心脏瓣膜组 织工程移植物。
[0073] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所掲示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
[0074] 本发明的主要优点在干：
[0075] 1、本发明采用戊二醛与原花青素共交联动物心脏瓣膜，使两种交联剂的优点互 ネト，从而制备优于戊二醛和原花青素単独交联制备的瓣膜。
[0076] 2、本发明提供的瓣膜材料減少了戊二醛用量，降低其细胞毒性。
[0077] 3、本发明提供的瓣膜材料的稳定性、抗血栓性、抗钙化能力和抗菌性都有很大提 高，保持瓣膜的天然形态、柔软性和血液相容性。
[0078] 下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按 重量计。
[0079] 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。
[0080] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0081] 下述实施例中涉及的性能測定的项目和相应的方法如下：
[0082] 形态学观察
[0083] 将未交联和交联后的脱细胞猪心脏瓣膜材料样品经如下常规电镜制样方法脱水、 制样，用扫描电子显微镜（SEM)观察脱细胞后的猪心脏瓣膜。将未交联和交联后的脱细胞 猪心脏瓣膜材料铺展在干净的蓝色纸上，使用数码相机拍摄瓣膜材料的直观形态。
[0084] 所述的常规电镜制样脱水步骤
[0085] (1)样品浸入0? 25%戊二醛溶液4小吋；PBS溶液洗三次；
[0086] (2)样品依次浸泡在系列浓度的乙醇溶液中（乙醇的体积份数分别为30%，50%， 70%，90%，95%，100%)，各10分钟，逐步替换样品中的水分；
[0087] (3)样品浸入体积分数为50%的六甲基二硅胺烷（HMDS)-乙醇溶液中10分钟，再 转入纯的六甲基二硅胺烷（HMDS)中10分钟，以逐步替换样品中的乙醇。
[0088] (4)样品放入通风橱中干燥过夜；
[0089] (5)观察之前，将干燥的样品喷上金粉以增加导电性能。
[0090] 力学性能：最大抗张强度的測定
[0091] 将未交联、GA、P2G5、P4G4、P5G3、P6G2、P8G1、PC各组交联的猪心脏瓣膜材料以及 保存在D-Hanks溶液中不同时间后的猪心脏瓣膜材料，沿胶原纤维的方向剪成宽约4mm，长 约25mm的长条。姆组6个样品，经SHIMADZU材料力学测试仪在2mm/min的拉伸速率下测 试张力。最大抗张强度的数值可从图中直接读出。
[0092] 抗钙化能力测定
[0093] 1.扫描电镜下能谱测定
[0094] 本发明主要应用模拟体液浸泡各实验组瓣膜材料后，使其对照组钙化，通过电镜 观察各组瓣膜材料的I丐沉淀-羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HA)的状况。将未交联和各 组交联的瓣膜材料分别浸泡在SBF中（IOmL/瓣膜)，在37°C恒温摇床中孵育10天。此后， 取出的瓣膜经D-Hanks溶液清洗ー小时。洗净后的瓣膜材料剪成4mmX5mm的大小，按前述 方法干燥后电镜观察。Ca/P比可用电镜配套设备能谱仪分析得出。
[0095] 所述的模拟体液SBF的配制
[0096]将分析纯级的CaC12,K2HPO4 ? 3H20,NaCl,KC1,NaHCO3,MgCl2. 6H20,和Na2SO4 按下 列配方精确称量后溶解在去离子水中，用Tris-HCl调pH至7. 25。此时其离子浓度接近人 体的体液。
[0097]SBF的组成与实际比较如表1所示：
[0098]表I.SBF与Bloodplasma的对比
[0099]
【主权项】
1. 一种人工生物心脏瓣膜材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤： (1) 将脱细胞心脏瓣膜和含有原花青素的溶液混合进行交联，得到脱细胞心脏瓣膜材 料a ; (2) 将脱细胞心脏瓣膜材料a和戊二醛溶液混合进行交联，得到共交联的脱细胞心脏 瓣膜材料；和 (3) 将共交联的脱细胞心脏瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心脏瓣膜材 料； 以所述含有原花青素的溶液的总体积计，其中原花青素的浓度为6-8mg/ml ;以所述戊 二醛溶液的总体积计，其中戊二醛的浓度为0. 1-0. 25%。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的混合在60-240转/分钟的速度 下进行。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联温度为10_42°C。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的交联时间为1-96小 时。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中所述的交联时间为1-24小 时。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中所述的混合温度为1-6°C。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中所述的混合时间为15-40 天，优选为30天。
8. 如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，每克瓣膜湿重加l-10ml D-Hanks溶液，优选为3ml。
9. 一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的人工生物心脏瓣膜材料。
10. -种如权利要求9所述的人工生物心脏瓣膜材料的用途，用作心脏瓣膜或用于制 备心脏瓣膜组织工程移植物。
【专利摘要】本发明公开了一种人工生物心脏瓣膜材料及制备方法和用途。所述制备方法包括步骤：（1）将脱细胞心脏瓣膜和含有原花青素的溶液混合进行交联，得到脱细胞心脏瓣膜材料a；（2）将脱细胞心脏瓣膜材料a和戊二醛溶液混合进行交联，得到共交联的脱细胞心脏瓣膜材料；和（3）将共交联的脱细胞心脏瓣膜材料和D-Hanks溶液混合，得到人工生物心脏瓣膜材料；以所述含有原花青素的溶液的总体积计，其中原花青素的浓度为6-8mg/ml；以所述戊二醛溶液的总体积计，其中戊二醛的浓度为0.1-0.25%。
【IPC分类】A61L27-36, A61L27-54
【公开号】CN104623732
【申请号】CN201310571743
【发明人】翟万银, 常江
【申请人】中国科学院上海硅酸盐研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日