一种避免加速血液清除现象的长循环脂质体、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及长循环脂质体，具体涉及一种避免加速血液清除现象的长循环脂质体，更具体地涉及一种含有聚羧基甜菜碱脂质的脂质体，包含其的药物制剂及它们的制备方法和应用
【背景技术】
[0002]脂质体作为药物载体具有生物相容性好、降低药物毒性、增加药物稳定性和增强药物靶向性等优点，脂质体作为药物载体一直备受广大研宄工作者的关注，脂质体作为药物载体已得到很多方面的应用。但以脂质体为载体的药物制剂易被网状内皮系统(RES)识另IJ，这虽然能提高某些治疗药物的安全性，但却不能有效发挥药物活性。通过高分子物质来改变脂质体表面亲水性亚结构，形成表面有高分子材料包裹的脂质体，尤其是表面用聚乙二醇(PEG)修饰的长循环脂质体，PEG通过氢键和溶剂中的水分子作用，在被修饰的脂质体表面形成一层水合层，掩盖脂质体表面正电荷，从而达到抑制蛋白质吸附并减少吞噬系统识别的作用，有效解决了上述问题。
[0003]基于PEG修饰的脂质体尽管细胞毒性低、血清稳定性好，操作简单，但是，研宄发现PEG修饰影响脂质体的细胞内吞和内涵体逃逸过程，导致药物分子无法有效释放进入细胞质，发挥药效。更重要的是，自2000年来，PEG化制剂给药的安全性和治疗的有效性受到了挑战。鉴于大多数PEG化制剂在临床应用上需要多次给药，Dams等(Dams ETM, LavermanP，Oyen WJGjet al.Accelerated blood clearance and altered b1distribut1n ofrepeated inject1ns of sterically stabilized liposomes[J].J Pharmacol expTher，2000，292:1071 - 1079)以"mT。标记脂质体，研宄大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情况，意外的发现第二次注射的脂质体血浆水平出现极大降低(20分钟时的浓度约为首次注射的10% )，且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%,即为加速血液清除(Accelerated Blood Clearance，ABC)现象。这一现象导致药物在革巴部位的富集下降，治疗效果差，甚至引起临床的毒副作用。一些研宄者通过改变脂质体表面PEG的化学结构或者改变给药途径来避免PEG化脂质体的这一现象，但是这样却使脂质体的长循环功能大大降低，并不能满足治疗的要求。
[0004]因此，目前的PEG化的脂质体，因存在影响脂质体的细胞内吞和内涵体逃逸的过程，且会产生多次给药的ABC现象，难以满足临床应用的需要。如何来寻找一种本领域中需要的毒性小、内吞效果明显，并且适用于多次给药可以避免ABC现象的长循环脂质体是解决冋题的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具有优异抗非特异性蛋白吸附性能的，可避免加速血液清除(accelerated blood clearance, ABC)现象的聚羧基甜菜碱(PCB)脂质分子修饰的脂质体，及其制备方法和应用。
[0006]为达此目的，解决现有技术中存在的上述问题，本发明的发明人进行了大量、细致的研宄工作，研宄发现:
[0007]1、新型脂质体的机制:1)脂质体利用细胞内吞作用进入细胞，形成内涵体；2)脂质体中聚羧基甜菜碱在内涵体的酸性条件下发生质子化带有正电荷，与内涵体中带负电荷的脂质发生静电相互作用；3)带负电荷的脂质由内涵体的腔外翻转到腔内，与正电荷脂质形成中性离子对，药物脱离脂质体后进入细胞质；4)药物在细胞内发挥疾病治疗作用。
[0008]2、用聚羧基甜菜碱脂质分子修饰的脂质体制备长循环脂质体的机制??聚羧基甜菜碱脂质的结构特征是，每个单体单元侧链都有一个阴离子基团(羧酸根基团)和一个阳离子基团(季胺基团)，总体表现电中性。两性离子聚合物利用阳离子和阴离子基团与水分子的静电相互作用吸附大量水分子，在被修饰脂质体表面形成水合层，有效抵抗非特异性蛋白质与脂质体的吸附作用，增强脂质体的血液稳定性，延长脂质体的血液循环时间，提高脂质体的内吞效率和内涵体逃逸能力，避免加快血液清除现象。
[0009]结合上述发现的结果，本发明采用以下技术方案:
[0010]第一方面，本发明提供了一种新型可避免加速血液清除(accelerated bloodclearance, ABC)现象的长循环空白脂质体，所述脂质体包括磷脂、辅助脂质和聚羧基甜菜碱脂质。
[0011]所述磷脂为1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)U-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)或二芥酰基卵磷脂(DEPC)中的任意一种或者至少两种的混合物，优选为POPC和DSPC。
[0012]所述辅助脂质为1，2_油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或胆固醇中的任意一种或者至少两种的混合物，优选为DOPE。
[0013]所述聚羧基甜菜碱脂质为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜碱(DSPE-PCBn)、I, 2-油酰基磷脂酰乙醇胺_聚羧基甜菜喊(DOPE-PCBn)、1，2-十八酰基_sn_甘油-聚羧基甜菜碱(DG-PCBn)、胆固醇-聚羧基甜菜碱(胆固醇-PCBn)或α -十六烷基丙三醇醚-聚羧基甜菜碱(HG-PCBn)中的任意一种或者至少两种的混合物，优选为DSPE-PCBn、DOPE-PCBn或胆固醇-PCBn*的任意一种或者至少两种的混合物，其中，所述聚羧基甜菜碱(PCBn)中聚合度η为1-500间任意整数，优选为1-100间任意整数，进一步优选为5_50间任意整数，最优选为10-30间任意整数。
[0014]所述磷脂:辅助脂质:聚羧基甜菜碱脂质摩尔比为η:1:m，其中η为0.1_100，优选为0.2-50，进一步优选为0.5-10 ；m为0.1-100，优选为0.2-10，进一步优选为0.4-1，例如可以是:0.1:1:0.1、0.2:1:0.2,0.5:1:0.4、1:1:0.5、2:1:0.6、5:1:0.8、8:1:0.9、10:1:1、20:1:5、30:1:8、40:1:10、50:1:12、60:1:20、70:1:50、80:1:60、90:1:80 或 100:1:100。
[0015]第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的新型避免ABC现象的长循环脂质体的方法，采用被动载药法或主动载药法制备所述新型长循环脂质体。
[0016]所述被动载药法包括薄膜分散法、超声分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法或注入法。
[0017]所述主动载药法包括pH梯度法、硫酸铵梯度法或醋酸铵梯度法，优选为薄膜分散法和硫酸钱梯度法，进一步优选为硫酸钱梯度法。
[0018]所述硫酸铵梯度法包括以下步骤:
[0019](I)按比例称取磷脂、辅助脂质和聚羧基甜菜碱脂质，使其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，减压旋蒸除去有机溶剂，形成油膜，用真空泵抽干，彻底除去有机溶剂；
[0020](2)加入硫酸铵溶液，水浴超声，形成半透明状乳液；
[0021](3)将上述乳液加入到高压均质机中过压，再将过压后的乳液加入脂质体挤出器中过膜，形成空白脂质体；
[0022](4)将空白脂质体置于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析；
[0023](5)将透析过的空白脂质体与待包载的药物分子置于水浴中孵育；
[0024](6)将包载药物分子的脂质体置于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析除去未包载的游离药物，制得新型长循环脂质体。
[0025]步骤(I)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或甲醇中的任意一种或者至少两种的混合物，优选为三氯甲烷和甲醇。
[0026]优选地，步骤(I)所述减压旋蒸的转速为30-300rpm，进一步优选为50-200rpm，最优选为 100_170rpm，例如可以是 30rpm、50rpm、80rpm、lOOrpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、220rpm、250rpm、280rpm 或 300rpm ；
[0027]优选地，步骤(I)所述减压旋蒸的温度为10_200°C，进一步优选为20_100°C，最优选为 40-80°C，例如可以是 10°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、Ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc、i6(rc、i7(rc、i8(rc、i9(rc 或 2oo°c。
[0028]优选地，步骤(I)所述真空泵抽干时间为l-72h，进一步优选为5-48h，最优选为15-36h，例如可以是 lh、5h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、25h、28h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h 或 72h。
[0029]优选地，步骤(2)所述硫酸铵溶液的质量浓度为0.1-80%,进一步优选为1-50%，最优选为 5-20%，例如可以是 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75% 或 80%。
[0030]优选地，步骤(2)所述水浴超声的频率为10-300HZ，进一步优选为30_200Hz，最优选为 60-150Hz，例如可以是 1Hz、20Hz、30Hz、40Hz、50Hz、60Hz、65Hz、7