一种猪支原体肺炎疫苗株的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，涉及一种新的猪支原体肺炎疫苗株的应用。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎（Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗 称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼 吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌（如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆 菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等）继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场 都有发生。由于带菌病猪的存在和分布较广，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪 群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因 而给猪场造成较为严重的经济损失。由国内外临床经验可知，接种疫苗，能够显著的降低猪 肺炎病变程度，降低饲养成本，是一种比较可行的预防方法。
[0003] 为了减少猪支原体肺炎对养猪业造成的损失，国内外许多学者进行了广泛研宄， 并取得了一定的成果。目前，国内自主研发的猪支原体肺炎疫苗只有弱毒疫苗，该疫苗由于 需要胸腔接种，所以不易于推广普及，而国外已有多家兽药公司研发生产了猪支原体肺炎 灭活疫苗，并在国内市场上销售，灭活疫苗可以通过肌肉注射进行接种，易于操作。由于国 内无自主研发的猪支原体肺炎灭活疫苗，市场上均依赖进口，可进口疫苗价格较为昂贵。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，提供一种猪支原体肺炎疫苗株的应用，该疫苗株用于猪肺炎 支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药。本发明的灭活疫苗所用的菌株是从国 内商品猪上分离得到的，对商品猪具有良好的免疫原性；本发明的灭活疫苗制备工艺简单， 安全有效，能够有效预防猪支原体肺炎疾病的发生。
[0005] 本发明所述的一种猪肺炎支原体疫苗株的应用，该猪支原体肺炎疫苗株在制备治 疗猪支原体肺炎的兽药中的应用，将疫苗株接种培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活 与佐剂混合制成，具体操作按下列步骤进行：
[0006] a、生产用种子制备：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并 按1 : 10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36-38°C恒温培养箱中培养48-72小 时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6. 70-6. 80时收取菌液，纯粹检验合格，作为一级种 子液，再重复制备二级种子液和三级种子液；
[0007] b、制苗用菌液制备：将步骤a得到的三级种子液按1 : 10加入改良Friis液体培 养基中，密闭发酵罐罐口，通入无菌空气，罐内压力达到〇. 〇8MPa时，关闭发酵罐上所有进 出口，保压，温度36-38 °C培养2-3天，pH值降低至6. 70-6. 80时取样，进行纯粹检验和含菌 量测定；
[0008] C、灭活：按步骤b中制备菌液总量的0. 2%加入甲醛溶液，在温度36-38°C灭活2 小时，再将灭活的菌液置温度2-8°C保存；
[0009] d、配苗：将步骤c中灭活的菌液与免疫佐剂混合，即得到猪支原体肺炎灭活疫苗， 再将疫苗无菌定量分装后，加盖密封，粘贴标签，置温度2-8 °C保存。
[0010] 步骤a和步骤b中的改良Friis液体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉 3. 0-5. 0g、脑心浸液粉2. 0-4. 0g、去离子水660-740. 0ml，辅助培养基为IOX汉克氏平衡盐 溶液 20-40. 0ml、酵母浸出液 20-40. 0ml、青霉素 100-300U/ml、杆菌肽粉 5-20U/ml、0. 25% 酚红5-10.0 ml和灭活的猪血清100-250.0 ml混合制成。
[0011] 步骤d中所述的免疫佐剂为氢氧化铝胶、MONTANIDE ISA 206、ISA 11R、ISA 760、 ISA 563 或 Gel Ol0
[0012] 本发明所述的猪支原体肺炎疫苗株的应用，所述的猪支原体肺炎疫苗株，于2010 年在新疆昌吉某猪场分离鉴定获得的一株猪支原体肺炎疫苗株。其分类命名为猪肺炎支原 体，菌株号为CJ株，已于2014年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 9909。
[0013] 本发明所述的改良Friis固体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3. 0-5. OgJ^ 心浸液粉2. 0-4. 0g、去离子水660-740.0 ml和琼脂粉10-15. 0g，辅助培养基为IOX汉克氏 平衡盐溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、 0. 25 %酚红5-10.0 ml和灭活的猪血清100-250.0 ml混合制成。
[0014] 本发明所述的猪支原体肺炎疫苗株的应用，其有益效果为：
[0015] (1)菌株免疫原性好：本发明的猪支原体肺炎疫苗株是从国内商品猪上分离得到 的新菌株，培养滴度高且具有良好的免疫原性，保证了疫苗的免疫效力。
[0016] (2)疫苗生产简便：该菌株在改良液体培养基上能够快速生长，菌液滴度高，适合 于大生产；用甲醛灭活，灭活完全且时间短，且甲醛本身是一种防腐剂，用其来灭活兼顾了 灭活和防腐，减少了用量以及对动物的不良反应；本发明的灭活疫苗中使用的免疫佐剂成 分简单，制苗方法简便，简化了生产工艺，降低了生产污染的风险。
[0017] (3)疫苗安全有效：本发明的猪支原体肺炎灭活疫苗（CJ株）经过安全检验和与 同类进口疫苗进行效力比对试验，证明疫苗是安全的，免疫保护效力与进口疫苗没有差异。
[0018] 总之，本发明的灭活疫苗免疫原性良好、生产简便、成本低廉，易于大范围推广应 用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【具体实施方式】
[0019] 通过下列实施例进一步说明本发明，而不限制本发明的范围；
[0020] 实施例1 :猪支原体肺炎灭活疫苗（CJ株）的制备：
[0021] 1 菌种：
[0022] I. 1制造本品用菌种为猪肺炎支原体CJ株（所述的猪支原体肺炎疫苗株，其分类 命名为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)，菌株号为CJ，已保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO :9909,保藏日期为2014年11月 06日），检验用菌种为猪支原体肺炎肺组织毒，均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 分离、鉴定、保管和供应；
[0023] 1.2生产用菌种：
[0024] 1.2. 1形态和生化特性：用液体培养物涂片，经姬母萨氏染色，在高倍镜下可见环 状、短链状和两极状等典型的多形态，并具有代谢葡萄糖的生化特性；
[0025] 1.2. 2培养特性：在改良Friis液体培养基中培养2-3日，呈轻度浑浊，在改良 Friis固体培养基上培养7-10日，肉眼可见针尖大小的菌落，显微镜下观察为外周质地疏 松、中央致密的圆形菌落，表面粗糙带有颗粒状；
[0026] 1. 2. 3生长抑制试验：吸取菌液涂布于改良Friis固体培养基上，置温度36-38°C 使琼脂表面稍干燥，夹取浸猪肺炎支原体抗血清纸片贴于琼脂表面，培养14日后，分离菌 株出现大于2. Omm的抑菌圈，其中所述的改良Friis固体培养基是由基础培养基为PPLO肉 汤粉3. 0-5. 0g、脑心浸液粉2. 0-4. 0g、去离子水660-740.0 ml和琼脂粉10-15. 0g，辅助培养 基为IOX汉克氏平衡盐溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌 肽粉5-20U/ml、0. 25 %酚红5-10.0 ml和灭活的猪血清100-250.0 ml混合制成；
[0027] 1. 2. 4免疫原性：用3-4周龄健康易感仔猪10头，5头各耳后颈部深层肌肉注射 猪支原体肺炎灭活疫苗（CJ株）2ml，另5头不注射作为对照，在同等条件下隔离饲养，一免 后14日，以相同途径与相同剂量进行二免，二免后14日，连同对照猪5头，各气管注射猪肺 炎支原体肺组织毒，连续观察28日进行剖检，按28分评分法对每头猪肺炎病变进行评分肺 炎病变减少率=(对照猪肺炎算术平均分-免疫猪肺炎算术平均分）/对照猪肺炎算术平 均分X 100%，按上述公式计算免疫组猪的肺炎病变减少率，免疫组猪肺炎病变减少率不低 于 60% ;
[0028] 1. 2. 5检验用菌种毒力：将猪支原体肺炎肺组织毒用无菌生理盐水稀释，气管注 射健康易感仔猪5头，连续观察28日，部分仔猪出现咳嗽或腹式呼吸；攻毒28日进行剖检， 患病猪出现典型的猪支原体肺炎肺部病变，在肺脏心叶、尖叶、膈叶前1/3部位以及中间 叶，出现"肉样"或"胰样"实质样病变，界限明显；
[0029] 2疫苗制造及半成品检验：
[0030] 2. 1生产用种子制备：
[0031] 2. I. 1 -级种子繁殖及鉴定：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养 基溶解，并按1 : 10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36-38°C恒温培养箱中培养 48-72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6. 70-6. 80时收取菌液，作为一级种子液，按 《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹，在温度2-8°C保存，使用期应不超过7日，继代应 不超过5代，其中改良Friis液体培养基为基础培养基为PPLO肉汤粉3. 0-5. 0g、脑心浸液 粉2. 0-4. 0g、去离子水660-740. 0ml，辅助培养基为IOX汉克氏平衡盐溶液20-40. 0ml、酵 母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.