一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米 粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] CpG-ODN是一种有效的免疫佐剂，其可通过细胞表面TLR-9受体来发挥佐剂效应， 从而诱导抗体产生体液免疫和细胞免疫应答，在治疗微生物慢性感染和肿瘤疫苗等领域具 有广阔的应用前景。但是，裸露的CpG-ODN在体内很容易被酶解，使得摄取效率降低，免疫 激活功能减弱且不能持久。
[0003] 硫代修饰的CpG-ODN可延长CpG-ODN在体内的半衰期。核酸骨架的硫代修饰可大 大增强核酸对核酸酶的抗性，增加其稳定性，延长其在体内外的作用时间，但硫代修饰核酸 与蛋白的非特异高亲和力结合而表现出细胞毒性。
[0004] 阳性脂质体-CpG-ODN复合物可提高CpG-ODN在体外的转染效率，然而正电荷脂质 体的快速的血浆清除率，相关的毒性和免疫反应等缺点严重妨碍了其在体内的应用。
[0005] 因此，有必要提供一种更安全地、增加 CpG-ODN在动物或人体内的稳定性的方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒，由壳 聚糖和寡聚脱氧核苷酸组成，该负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒不仅能刺激机体产生 较强的免疫效应，还能提高CpG-ODN在体内的稳定性，延长CpG-ODN在体内的半衰期；此外， 该负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒细胞毒性小，安全高；本发明还提供了一种负载寡 聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法和应用。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒，由壳聚糖 和寡聚脱氧核苷酸组成，所述壳聚糖和寡聚脱氧核苷酸的质量比为10~30:1，所述寡聚 脱氧核苷酸为未甲基化的DNA序列，所述DNA序列包括一个5' -ATCGAT-3'基序，一个 5' -GGCGTT-3' 基序，两个 5' -GTCGTC-3' 基序，两个 5' -AACGTT-3' 基序。
[0008] 所述 5'-ATCGAT-3'基序、5'-GGCGTT-3'基序、5'-GTCGTC-3'基序及 5'-AACGTT-3' 基序的核苷酸序列分别如SEQ ID NO :2~5所示。
[0009] 优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径为112~121nm。
[0010] 优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为80~146mV。
[0011] 优选地，本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径、Zeta电位皆 为各批次的平均数值，每个批次所得的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径、Zeta 电位符合正态分布。
[0012] 进一步优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径为112. 6nm。
[0013] 该112. 6nm的壳聚糖纳米粒的粒径为平均粒径。
[0014] 进一步优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为 146.OmV。
[0015] 该146. OmV的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为平均Zeta电位。
[0016] 在具有较高DNA包覆率的前提下，本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳 米粒的电位较大，粒径较小，易于吸附到带负电的细胞膜上，且对细胞伤害小，毒性低，细胞 转染率高。
[0017] 优选地，所述的壳寡糖的分子量在80000~160000Da之间。
[0018] 优选地，所述的壳寡糖的脱乙酰度在90%~98%之间。
[0019] 进一步优选地，所述的壳寡糖的分子量为80000Da。
[0020] 进一步优选地，所述的壳寡糖的脱乙酰度为95%。
[0021] 优选地，所述 DNA 序列为 5' -CGNNATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTG TCGTTAACGTTNNNNNNCG-3'，其中，N 为 A、T、C 或 G。
[0022] 所述 5' -CGNNATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTNNN NNNCG-3' 的核苷酸序 列如SEQ ID NO :6所示。
[0023] 优选地，所述DNA序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0024] 壳聚糖是一种生物可降解的正电荷多聚糖，是甲壳素脱乙酰基产物，其无毒且具 有良好的生物相容性。壳聚糖在酸性条件下带有正电荷，在醋酸溶液中能有效的结合核酸， 能够有效地保护核酸免受核酸酶的降解，使核酸稳定性显著提高；本发明采用壳聚糖和寡 聚脱氧核苷酸（CpG-ODN)通过共聚交联复合形成的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒能 有效保护CpG-ODN，在不需要对核酸进行硫代修饰的前提下，能有效提高CpG-ODN在体内的 稳定性，延长CpG-ODN在体内的半衰期。此外，与脂质体相比，壳聚糖作为非病毒转运系统 用于基因治疗是一个更安全的选择。
[0025] 本发明制备的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒中的壳聚糖带正电荷， CpG-ODN为带负电荷，CpG-ODN通过静电吸附或物理吸附的作用吸附壳聚糖，包封率较高， 形成的纳米粒比较稳定，该纳米粒为CpG-ODN与壳聚糖相互交联而成的复合物。
[0026] 本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒由CpG-ODN通过静电吸附或 物理吸附的作用吸附壳聚糖，包封率较高，形成的纳米粒比较稳定，能提高CpG-ODN在体内 的半衰期；与使用硫代修饰稳定的CpG-ODN相比，本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳 聚糖纳米粒细胞毒性很小，使用更加安全；与阳性脂质体-CpG-ODN复合物稳定的CpG-ODN 相比，本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒能在体内长时间更有效、安全、稳 定地释放CpG-ODN，发挥佐剂效应。
[0027] 第二方面，本发明提供了一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法， 包括以下步骤：
[0028] (1)制备浓度为10~30ug/ml、PH 6. 5~8. 0的壳寡糖溶液；
[0029] (2)将寡聚脱氧核苷酸溶解在缓冲液中，得到寡聚脱氧核苷酸溶液，所述寡聚脱氧 核苷酸溶液中，所述寡聚脱氧核3苷酸的浓度为步骤（1)所述壳寡糖溶液浓度的0. 03~ 〇· 1 倍；
[0030] (3)在60~75°C条件下，将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚脱 氧核苷酸溶液按〇. 2~5:1的体积比混合均匀后，得到所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖 纳米粒，在所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒中，所述壳聚糖和寡聚脱氧核苷酸的 质量比为10~30:1，所述寡聚脱氧核苷酸为未甲基化的DNA序列，所述DNA序列包括一个 5'-ATCGAT-3'基序，一个 5'-GGCGTT-3'基序，两个 5'-GTCGTC-3'基序，两个 5'-AACGTT-3' 基序。
[0031] 优选地，所述步骤（1)还包括将所述制备的壳寡糖溶液置于60~75°C的水浴条件 下恒温5~30分钟。
[0032] 优选地，所述步骤（2)还包括将所述制备的寡聚脱氧核苷酸溶液置于60~75°C的 水浴条件下恒温5~30分钟。
[0033] 进一步优选地，所述步骤（1)还包括将所述制备的壳寡糖溶液置于65~70°C的水 浴条件下恒温10~30分钟。
[0034] 进一步优选地，所述步骤（2)还包括将所述制备的寡聚脱氧核苷酸溶液置于65~ 70°C的水浴条件下恒温10~30分钟。
[0035] 更进一步优选地，所述步骤（1)还包括将所述制备的壳寡糖溶液置于65°C的水浴 条件下恒温10分钟。
[0036] 更进一步优选地，所述步骤（2)还包括将所述制备的寡聚脱氧核苷酸溶液置于 65 °C的水浴条件下恒温10分钟。
[0037] 本发明采用先将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚脱氧核苷酸溶 液分别预加热到60~75°C，再将二者进行混合的方式可以降低溶液黏度，防止步骤（3)混 合形成纳米粒子时发生骤聚，此外，这个温度不会对DNA造成损伤。
[0038] 优选地，所述步骤（1)中，所述制备浓度为10~30ug/ml、pH 6. 5~8. 0的壳寡糖 溶液的步骤包括：先在pH为5. 5~6. 5的条件下溶解壳寡糖，得到pH为5. 5~6. 5的壳寡 糖溶液；再调节所述pH为5. 5~6. 5的壳寡糖溶液的pH至6. 5~8. 0。
[0039] 进一步优选地，所述步骤（1)中，所述制备浓度为10~30