鉴定协同化妆品组合的方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般来讲涉及鉴定或评估用于个人护理组合物中的有益活性成分的组合 方法。更具体地，本发明涉及鉴定或评估抵抗氧化应激反应对皮肤细胞的效应的活性物质 的协同组合的方法。
【背景技术】
[0002] 生命的根本性基础是生物体产生能量的需求和能力。在人类中，食物被摄入并转 化为化合物诸如三磷酸腺苷（"ATP"）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（"NAD"），它们存储被身 体的细胞用于进行维持生命的生物学过程的能量。将食物的有用组分（例如，碳水化合物、 脂肪和蛋白质）转化为可用的能量的细胞代谢途径是复杂的，并且可以尚未被全面地理解 的方式被多种因素影响。哺乳动物的皮肤细胞也不例外。皮肤细胞已知包括以动态的、复杂 的关系共同起作用，以维持皮肤的健康状态的多种不同类型的细胞。例如，角质细胞增殖和 分化，以提供皮肤的连续代谢周转。已知黑素细胞提供用于皮肤色素沉积的黑素合成。而 成纤维细胞已知合成细胞外基质和胶原，其帮助维持皮肤的厚度和弹性。相似地，存在于皮 肤或其他身体器官内或周围的其他细胞，诸如肌细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞、和脂 肪细胞，均需要来源于能够被多种不同因素不利地影响的复杂代谢途径的能量。
[0003] 各种紧张性刺激对细胞的生物能量学的影响和对细胞老化、以及其他疾病（例 如，癌症、神经退行性疾病、糖尿病、和心血管疾病）的影响的了解越来越多。代谢的改变在 疾病状态中的一些这些效应背后的一种理论是老化的自由基理论。即，哺乳动物细胞暴露 于反应性氧物质（"ROS"）导致细胞结构和细胞器诸如线粒体的损伤。ROS是包含氧的高 度反应性的分子（例如，氧离子和过氧化物）。ROS作为氧的正常代谢的天然副产物在细胞 中天然地形成，并在细胞信号转导和体内平衡中发挥作用。然而，当细胞暴露于诸如热或紫 外线辐射的紧张性刺激时，ROS水平能够升高，并且在一些情况下显著地升高。
[0004] 由于ROS导致的损伤随着时间积累，其在细胞水平导致越来越多的氧化应激反 应，这最终可导致组织的损伤和/或器官功能障碍。氧化应激反应对细胞的一种效应是细 胞的生物能量学能力的减弱，这能够导致降低的ATP和/或NAD水平。这对于人类皮肤而言 可能是尤其成问题的，因为在人类皮肤细胞上的氧化应激反应可显示为老化的可见信号。 另外，诸如紫外线辐射（"UV"）和污染物（例如，香烟烟雾、汽车尾气、臭氧）的环境紧张性 刺激能够导致ROS产生水平的升高。随时间推移，这可导致皮肤的结构和形态的显著变化 (例如，"光损伤"），并且，在更加极端的程度，导致皮肤癌。
[0005] 人类皮肤细胞通过利用诸如谷胱甘肽和NAD的氧化还原调节剂以及能够中和ROS 的各种酶来抵御R0S。然而，这些防御能够被紧张性刺激诱导的ROS的高峰击败，导致能量 内稳态和代谢效率的急性的以及慢性的改变，总体上导致细胞的功能障碍。使情况复杂的 是，与人类皮肤相关联的细胞类型的多样性和这些细胞的代谢途径的复杂性，使得难以鉴 定合适的化合物来帮助抵抗与暴露于特定的氧化紧张性刺激或紧张性刺激的组合相关联 的抗衰老效应。某些氧化紧张性刺激不同地影响不同类型的细胞和/或代谢途径。这使得 难以选择抵抗特定的一种或多种紧张性刺激的不期望的效应的合适的护肤活性物质或活 性物质的组合（其效应也可根据细胞或代谢途径的类型而变化）。虽然鉴定防止、减少和/ 或逆转氧化应激反应对细胞的效应的活性物质是所期望的，甚至更加期望的是鉴定共同起 作用以提供优于使用单种活性物质的优势的活性物质的组合。这有时被称为协同作用。鉴 定单独起作用以抵抗氧化应激反应的效应的护肤活性物质能够是困难的，而快速和/或有 效地鉴定协同地起作用的护肤活性物质能够是艰难的。因此，存在对鉴定抵抗与多种氧化 紧张性刺激（尤其是通常的环境紧张性刺激）相关联的不期望的代谢效应的护肤活性物质 的协同组合的方法的需求。
[0006] 作为发现护肤活性物质的协同组合的初始步骤，必须鉴定能够检测由紧张性刺激 和活性物质导致的细胞代谢变化的方法。用于评估细胞的产能过程的多种方法是已知的。 例如，Clark型电极探针用于测量氧气消耗是已知的。Clark电极提供动力学信息（即，响 应的速率），但其连续的氧气消耗引入了伪迹（即，影响测试结果的一些不期望的和/或外 部的因子），呈现了测量腔室中对细胞或分离的线粒体的氧气压力的降低。尽管氧气消耗可 提供线粒体功能的指示，其仅测量了细胞的生物能学的一部分，并且没有提供对有助于生 物能学平衡的其他代谢途径（即糖酵解）的评估。
[0007] 用于评估细胞的产能的另一个常规方法是通过测量细胞中ATP的量。用于对总的 能量代谢定量的发光ATP检测试剂盒是可商购获得的。ATP测定已知是相对灵敏的，但它 们可能不是线粒体功能的理想度量，因为细胞尽力维持特定的ATP预算并将相应地调整代 谢。因此，ATP水平的改变通常仅在病理生理改变期间可检测。此外，ATP测定是破坏性的 (即，为了测量ATP的量，细胞被破坏）并且它们缺少动力学信息。另外，来自垂死或死亡细 胞中存在的残余ATP的伪迹已被报道。并且类似Clark电极测定，ATP不能确定不同的代 谢途径对总的ATP产量的相对贡献。
[0008] 另一种用于评估细胞能量学的常规方法是使用可商购获得的MTT/XTT或 alamarBlue?试剂盒。虽然这些试剂盒可提供评估细胞健康状态的相对简单的方式，但它 们不像ATP测定那样灵敏。此外，它们还被报道通过细胞毒性引入误差，而这正好是它们预 期要测量的参数。另外，两种测定均为破坏性的，并且不提供动力学信息。
[0009] 因此，希望提供鉴定和/或评估减少、防止和/或逆转在皮肤细胞上的不期望的氧 化应激反应的活性物质的有益组合的方法。提供包括通过上述方法鉴定的护肤活性物质的 护肤组合物也将是可取的。还将可取的是提供处理被特定紧张性刺激的氧化应激效应损伤 的皮肤的方法。
【附图说明】
[0010] 图1A、Ib和IC示出了角质细胞的氧气消耗速率。
[0011] 图2示出了角质细胞的氧气消耗速率。
[0012] 图3A、3B和3C示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
[0013] 图4示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
[0014] 图5A、5B、5C、ro和5E示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
[0015] 图6示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
[0016] 图7A、7B、7C、7D和7E示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0017] 图8示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0018] 图9示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
[0019] 图10示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
【发明内容】
[0020] 为了提供对前述问题的解决，本文公开了鉴定或评估用于个人护理组合物中的活 性物质的协同组合的方法。所述方法包括：(a)提供第一测试容器、第二测试容器和第三测 试容器，每一测试容器包含配置在培养基中的细胞；(b)使所述第一测试容器中的细胞与 第一受试试剂接触；（c)非致死地检测所述第一测试容器中的细胞的与糖酵解代谢途径和 氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述第一受试试剂的 响应；（d)使所述第二测试容器中的细胞与第二受试试剂接触；（e)非致死地检测所述第二 测试容器中的细胞的与糖酵解和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一 代谢途径对所述第二受试试剂的响应；(f)使所述第三测试容器中的细胞与所述第一受试 试剂和第二受试试剂的组合接触；(g)非致死地检测所述第三测试容器中的细胞的与糖酵 解代谢途径和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述第 一受试试剂和第二受试试剂的组合的响应；以及（h)当（g)中的糖酵解和氧化磷酸化代谢 途径响应中的至少一种是优于（c)或（e)中的相同代谢途径的对应响应的改善时，将所述 第一组合物和第二组合物的组合鉴定为活性物质的有益的协同组合。
[0021] 在一些实施例中，所述方法可包括：(a)提供包括配置在第一培养基中的第一类 型细胞的第一测试容器和包括配置在第二培养基中的第二类型细胞的第二测试容器；(b) 提供所述第一类型细胞和第二类型细胞的糖酵解代谢途径和氧化磷酸化代谢途径各自的 基础值；（c)使所述第一类型细胞和第二类型细胞与组合的第一受试试剂和第二受试试剂 接触；（d)非致死地检测与所述第一类型细胞和第二类型细胞的糖酵解和氧化磷酸化代谢 途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对组合的所述第一受试试剂和第二受试 试剂的响应；以及（e)当所述第一类型细胞和第二类型细胞各自的糖酵解和氧化磷酸化代 谢途径中的至少一种的响应表明优于对应的基础值的改善时，将所述第一受试试剂和第二 受试试剂的组合鉴定为活性物质的有益的组合。
[0022] 在一些实施例中，所述方法可包括：(a)提供第一测试容器、第二测试容器和第三 测试容器，每一测试容器包含配置在培养基中的细胞；(b)使所述第一测试容器中的细胞 与第一受试试剂接触；（c)非致死地检测所述第一测试容器中的细胞的与糖酵解代谢途径 和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述第一受试试剂 的响应；（d)使所述第二测试容器中的细胞与第二受试试剂接触；（e)非致死地检测所述第 二测试容器中的细胞的与糖酵解和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每 一代谢途径对所述第二受试试剂的响应；（f)使所述第三测试容器中的细胞与所述第一受 试试剂和第二受试试剂的组合接触；（g)非致死地检测所述第三测试容器中的细胞的与糖 酵解代谢途径和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述 第一受试试剂和第二受试试剂的组合的响应；以及（h)当（g)中的糖酵解和氧化磷酸化代 谢途径响应中的至少一种不劣于（c)和（e)中的相同代谢途径的响应，并且所述第一受试 试剂和第二受试试剂中的至少一种提供优于所述第一受试试剂和第二受试试剂中的另一 个的非代谢的有益效果时，将所述第一受试试剂和第二受试试剂的组合鉴定为活性物质的 有益的组合。
[0023] 在一些实施例中，公开了包含护肤活性物质的协同组合的个人护理组合物，所述 组合物包含：(a)皮肤病学可接受的载体；(b)作为第一活性物质的安全且有效量的烟酰 胺；和（c)作为第二活性物质的安全且有效量的生育醌，其中所述安全且有效量的烟酰胺 和生育醌的组合改善由于暴露于紧张性刺激而遭受氧化应激反应的皮肤细胞的糖酵解和 氧化磷酸化代谢中的至少一种，并提供优于单独使用所述活性物质的协同的优势。
【具体实施方式】
[0024] 除非另外指明，所有百分比均按个人护理组合物的重量计。除非另外特别说明，所 有的比率均为重量比。所有数值范围是包括端值在内的较窄的范围；描述的范围上限和下 限是可互换的，以形成没有明确描述的其它范围。有效数位的数字既不限制所指示的量也 不限制测量精度