（T)喷点有抗 CCTy单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0021] 本发明的目的在于提供一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因(ΧΤγ，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。
[0022] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0023] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 11，下游引物序列为SEQ ID NO. 12。
[0024] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TRIzol? Reagent (invitrogen，货号 15596-018)进行样本RNA提取。
[0025] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2C〇pieS/ μ 1，最小检出浓度为IOOcopies/ μ 1。
[0026] 本发明目的是提供了一种骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测(ΧΤγ蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0027] 本发明目的是提供了一种检测骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与CCT γ 基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0028] 图ICCT γ基因在癌组织及正常组织中相对表达量图
[0029] 图2RNA干扰后各组CCT γ mRNA表达水平
[0030] 图3RNA干扰前后MG-63细胞增殖变化
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0032] 实施例1高通量测序及分析
[0033] 分别收集5例骨肉瘤病例样本及3例正常对照组织，进行RNA提取，RNA提取后琼 脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进 一步的转录组分析。进而通过NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq 测序的样品要求：0D260/0D280为1. 8-2. 2。
[0034] 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录 组深度测序，测序后我们运用 Fast-QC (http ://www. bio informat i cs. babraham. ac. uk/ projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值 的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析 时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，L0G2FC > 1或< -1，FDR < 0. 05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了 Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分 析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因（ΧΤγ。
[0035] 实施例2骨肉瘤组织及正常组织CCT γ基因表达情况
[0036] -材料和方法
[0037] 1、材料
[0038] 收集65例骨肉瘤组织及25例正常组织，对其进行分组及编号。
[0039] 2、方法
[0040] 2. 1骨肉瘤组织及正常组织总RNA的提取
[0041] 米用 TRIzol? Reagent (invitrogen，货号 15596-018)进行样本 RNA 提取，实验操 作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0042] 收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样 本成粉末状后：
[0043] ①加入Trizol，室温保存5分钟；
[0044] ②加氯仿0. 2ml，用力振荡离心管，充分混勾，室温下放置5分钟-10分钟；
[0045] ③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相（吸70% )到另一新离心管管中， 注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的_20°C预冷异丙醇，充分 颠倒混匀，置于冰上10分钟；
[0046] ④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I ml/ml Trizol的比例加入 75% DEPC乙醇洗漆沉淀（4°C保存），洗漆沉淀物，振荡混合，4°C下12000rpm高速离心5分 钟；
[0047] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解 沉淀；
[0048] ⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70°C。RNA质 量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、 18S条带；70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
[0049] 2. 2逆转录合成cDNA
[0050] 米用Superscript? III Reverse Transcriptase (invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0051] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1 μ g总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25 μ 1反应体系，每个样品取1 μ g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
[0052] 5X 逆转录缓冲液 5 μ 1，lOmmol/1 dNTP L 25 μ 1，0· lmmol/1 DTT 2. 5 μ 1， 30ymmol/101igodT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1·25μ1，模板 RNA lyg，加入灭菌水至总体系 25 μ 1。42°C孵育1小时，72°C 10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20°C冰箱备用。
[0053] 2. 3 Real-Time PCR
[0054] 2. 3. 1仪器及分析方法
[0055] 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2- Λ Λ CT法进行数据的相对定量分析。
[0056] 2.3.2引物设计
[0057] 采用在线引物设计软件，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如 下：
[0058] 表1引物序列
[0059]
【主权项】
1. CCT Y基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗骨肉瘤制剂可以采用下述方法中 的一种和/或几种抑制骨肉瘤细胞中CCT Y基因的表达：通过激活CCT Y基因的抑制基因、 激活抑制CCT Y基因表达的蛋白、导入抑制CCT Y基因表达的siRNA、激活促进CCT Y mRNA 降解的microRNA、导入促进CCTy蛋白降解的分子、抑制促进CCTy基因表达的因子及蛋白 的表达。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制CCT Y基因表达的SiRNA序列选 自下列序列中的一种和 / 或几种：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6。
4. 一种抗骨肉瘤制剂，其特征在于，所述抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞中CCTy基因 的表达。
5. 根据权利要求4所述的抗骨肉瘤制剂，其特征在于，所述的抗骨肉瘤制剂中含有抑 制CCTy基因表达的siRNA。 6. CCTy基因在制备骨肉瘤诊疗制剂中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用荧光定 量PCR方法、基因芯片方法检测骨肉瘤组织中CCTy基因的表达。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的用于荧光定量PCR方法检测骨肉 瘤中CCTy基因的产品含有一对特异性扩增CCTy基因的引物；所述的基因芯片包括与 CCTy基因的核酸序列杂交的探针。
9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用免疫方 法检测肺腺癌中CCT y蛋白的表达。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测骨肉瘤中CCT Y蛋白 表达的为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
11. 一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因CCTy， 采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQID NO. 9,下游引物序列为SEQ ID NO. 10〇
【专利摘要】本发明涉及伴侣素CCTγ在制备肿瘤诊断试剂中的应用，具体的本发明涉及伴侣素CCTγ在制备骨肉瘤诊断试剂中的新用途。发明人基于高通量测序结果采用生物信息学方法分析进行基因筛选，挑选出候选基因CCTγ，进一步，通过分子细胞生物学实验证实了CCTγ与骨肉瘤具有很好的相关性，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】A61K48-00, C12Q1-68, A61P35-00, A61K31-7088
【公开号】CN104721836
【申请号】CN201510075918
【发明人】杨承刚, 崔双双, 边洋, 孙耀兰
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月13日