纤维化的柚皮素和积雪草酸组合治疗的制作方法
【专利说明】纤维化的柚皮素和积雪草酸组合治疗
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2012年10月26日提交的美国临时专利申请第61/719，107号的优先权，所述临时专利申请的内容为了所有目的通过引用整体并入。
[0003]发明背景
[0004]纤维化为涉及在通常响应于损伤、疾病或其它外部刺激的器官中或解剖位置处纤维结缔组织过量形成的过程。此类过量的纤维组织倾向于破坏或甚至替换原始组织正常细胞结构，可导致正常组织或器官严重削弱或完全丧失生理功能。因为纤维化可在几乎所有器官中发生并且可显著地影响个体健康或甚至由于器官衰竭而引起死亡，所以在持续的医学研宄中已经进行了许多努力致力于治疗或预防纤维化。
[0005]由于人体健康中纤维化的医学普遍性和重要性，仍急切需要开发新的且有效的用于治疗和预防纤维化的方法。本发明满足了该点和其它相关需求。
[0006]发明概述
[0007]柚皮素和积雪草酸已经单独地被认为参与和组织纤维化的形成相关的不同的信号传导途径。本发明人做出了令人惊讶的发现，当柚皮素和积雪草酸一起施用时，在抑制纤维化中实现协同效应。虽然柚皮素和积雪草酸的每一种在调节纤维化-相关的信号传导中的作用为先前已知的，但是两种化合物组合使用的此类协同效应直到现在才被认识到。因此，本发明提供有效治疗和预防纤维化的新型方法和组合物。
[0008]在一个方面，本发明提供抑制组织纤维化的新的方法。所述方法包括使组织与有效量的柚皮素和积雪草酸接触的步骤。组织可以为器官，诸如肝、肾或肺的一部分。在一些实施方案中，接触步骤包括皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用或口服施用。在一些实施方案中，有效量为约5mg/kg体重至250mg/kg体重的柚皮素和lmg/kg体重至50mg/kg体重的积雪草酸。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以约10:1的重量比施用。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以单一组合物施用。在其它实施方案中，柚皮素和积雪草酸以两种单独的组合物施用。柚皮素和积雪草酸以任何适当的形式施用，包括但不限于溶液、粉剂、片剂或胶囊。
[0009]在另一方面，本发明提供新的组合物，所述组合物包含(I)有效量的柚皮素和积雪草酸以及(2)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，柚皮素和积雪草酸以约10:1的重量比存在。在一些实施方案中，配制所述组合物用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内或口服施用。例如，组合物可以呈溶液、粉剂、片剂或胶囊的形式。
[0010]在另一方面，本发明提供用于抑制纤维化的试剂盒。试剂盒含有至少两个容器:第一容器含有第一组合物，其包含柚皮素；第二容器含有第二组合物，其包含积雪草酸。在一些实施方案中，配制第一组合物用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用或口服施用。在一些实施方案中，配制第二组合物用于皮下施用、肌内施用、静脉内施用、腹膜内施用或口服施用。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于施用第一组合物和第二组合物的说明书。
[0011]在上述方面的任一者中，柚皮素和积雪草酸的协同疗效通过用积雪草酸的两种已知类似物---羟基积雪草酸和积雪草苷替代积雪草酸与柚皮素组合使用来实现。
[0012]附图简述
[0013]图1.积雪草酸和柚皮素的组合进一步减弱UUO-诱导的肾胶原蛋白I沉积。A.免疫组织化学结果表明单独的积雪草酸或柚皮素治疗减少梗阻性肾中的胶原蛋白I沉积，积雪草酸和柚皮素的组合进一步抑制蛋白质水平的UUO-诱导的胶原蛋白产生。B.实时PCR结果确认积雪草酸和柚皮素的组合很大程度上下调梗阻性肾病中的mRNA水平的胶原蛋白I合成。数据表示6-8只小鼠的平均值土SEM。对比假手术组，*#P〈0.001 ;对比UU0+DMS0组，#P<0.05，###P<0.0Olo AA:积雪草酸治疗；Nar:柚皮素治疗；CB:组合治疗。
[0014]图2.积雪草酸和柚皮素的组合进一步降低UUO-诱导的a -SMA+肌成纤维细胞渗入。Α.免疫组织化学结果表明单独的积雪草酸或柚皮素治疗降低梗阻性肾中的a-SMA+肌成纤维细胞渗入，积雪草酸和柚皮素的组合进一步减少渗透的α -SM+肌成纤维细胞的数目；Β.实时PCR结果显示积雪草酸和柚皮素的组合大体上下调梗阻性肾病中的mRNA水平的α-SMA。数据表示6-8只小鼠的平均值土SEM。对比假手术组，#*P〈0.001;对比UU0+DMS0组，#P<0.05，###P<0.001。Μ:积雪草酸治疗；Nar:柚皮素治疗；CB:组合治疗。
[0015]图3.积雪草酸和柚皮素的组合降低梗阻性肾中的Smad3信号传导，同时增加Smad7水平。A.蛋白质印迹分析结果表明积雪草酸和柚皮素的组合进一步降低UUO-诱导的Smad3磷酸化同时拮抗蛋白质水平的UUO-诱导的Smad7降解；B.实时PCR结果显示积雪草酸和柚皮素的组合下调梗阻性肾病中的mRNA水平的Smad3同时诱导Smad7合成。数据表示6-8只小鼠的平均值土SEM。对比假手术组，*P〈0.05, #P〈0.01 ;对比UU0+DMS0组，##P<0.01o AA:积雪草酸治疗；Nar:柚皮素治疗；CB:组合治疗。
[0016]图4.积雪草酸和柚皮素的组合进一步降低体外肝星状细胞和肾管状上皮细胞中TGF-β 1-诱导的纤维化响应。Α.积雪草酸和柚皮素的组合进一步下调肝星状细胞中响应于TGF-β I的Col.1和a -SMA mRNA水平蛋白质印迹分析和半定量数据显示积雪草酸和柚皮素的组合阻断肾管状上皮细胞中TGF-β 1-诱导的Col.1产生。数据表示3-4个体外独立实验的平均值土SEM。仅对比DMSO组，*P〈0.05，#P〈0.01，*#P〈0.001 ;对比TGF-β I+DMSO 组，#Ρ<0.05，##Ρ<0.01，###Ρ<0.001。AA:积雪草酸治疗；Nar:柚皮素治疗；CB:组合治疗。
[0017]定义
[0018]本文使用的术语“抑制(inhibiting) ”或“抑制(inhibit1n) ”是指对革E标生物过程或病理过程，诸如纤维化的开始或进展的任何可检测的不利作用或抑制作用。通常，当与对照相比时，抑制体现在靶标过程特有的特征(如纤维结缔组织的存在或新形成)减少至少 10%、20%、30%、40%或 50%。
[0019]术语“纤维化”描述在修复过程或反应过程中过量的纤维结缔组织在器官或组织中形成。纤维化不同于作为器官或组织的正常组分的纤维组织的形成。疤痕形成为消灭潜在的器官或组织的结构的融合性纤维化。纤维化可在几乎所有器官和组织类型中发生。纤维化的实例包括:肺纤维化(肺)；肝硬化(肝)；心内膜纤维化(心脏)；纵隔纤维化(纵隔的软组织)；骨髓纤维化(骨髓)；腹膜纤维化(腹膜的软组织)；进行性大块纤维化(肺)；肾源性系统性纤维化(肾)；克罗恩病(肠)；瘢痕疙瘩(皮肤)；陈旧性心肌梗塞(心脏)；和硬皮病/系统性硬化症(皮肤，肺)。
[0020]本文使用的术语“有效量”是指施用物质而产生疗效的物质的量。效果包括预防、校正或抑制疾病或病患症状的进展和相关并发症进展至任何可检测的程度。在两种或更多种物质用于期望效果的情况下，“有效量”可以以多于一种方式表示。例如，“有效量”可以以所有活性成分的总量表示，或以每种活性成分的单独的量表示，或以一种成分与另一种成分的比(如，重量比或体积比)表示。“有效量”的精确量将取决于治疗目的以及活性物质的形式和身份，并且将由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见，如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(第 1-3卷，1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)； 以及 Pickar,DosageCalculat1ns(1999))。
[0021]“柚皮素”为系统(IUPAC)名称为5，7- 二羟基_2_(4_羟基苯基)色满_4_酮和异名为4’，5，7-三羟基黄烷酮(CAS编号480-41-1)的黄烷酮。其化学式为(:15氏205并且分子量为272.257。实际上，柚皮素最丰富地存在于葡萄柚、橙子和西红柿外皮中。高纯度的柚皮素可购自多个商业供应商。
[0022]“积雪草酸”为来源于植物积雪草(Centella asiatica)，通常被称为雷公根(GotuKola)的古老的、常规的中药提取物。其还被称为达玛醇酸(CAS编号464-92-6)。其化学式(Hill Notat1n)为C3tlH48O5，并且分子量为488.70。积雪草酸与其类似物---羟基积雪草酸和积雪草苷共有许多相似性。其可通过商业供应商诸如Sigma-Aldrich获得。
[0023]本文使用的术语“施用”涵盖将物质，如具有治疗效果或预防效果的药剂递送至受试者的任何方式，所述方式可以包括但不限于全身应用、区域应用和局部应用。“施用”的实例为注射(诸如通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内方式)、口服摄取、通过鼻腔或通过眼睛或耳朵摄入、吸入、透皮递送以及肛门或阴道沉积等。
[0024]术语“药学上可接受的赋形剂”和“生理上可接受的赋形剂”可以互换使用，是指包含在含有实现某些特性的活性成分的组合物的制剂中，而本身不会不利影响活性成分的预期治疗效果或预防效果的惰性物质，所述某些特性为诸如更期望的PH、溶解度、稳定性、生物利用率、质地、一致性、外观、风味/味道、粘度等。
[0025]本文使用的术语“组织”是指其生物属性，诸如形态学和生物活性相似并且来自相同来源使得这些细胞一起执行特定功能的全体细胞。“器官”为以结构单元连接的行使共同功能的不同组织的集合。
[0026]本文使用的术语“约”描述引用值的正或负10%的范围。例如，“约10”的数值可为10±1范围内的任何数值，即9至11。
[0027]发明详述
[0028]1.导言
[0029]器官(肝、肾、肺和心脏等)纤维化或疤痕形成为导致晚期器官衰竭的主要原因和最终途径。组织纤维化的特征为肌成纤维细胞和细胞外基质的过度积聚。然而，至今纤维化的治疗很大程度上仍为无效的和非特异性的。因此，迫切需要搜寻和开发抗纤维化策略以便防止、停止或逆转纤维化。通常认为TGF-β/Smads介导纤维化。本研宄中的发现示出TGF- β I通过其下游被称为Smad3的介质积极地介导组织症痕形成，但通过Smad7消极地介导组织疤痕形成。在多种慢性器官疾病中，纤维化随着TGF-β/Smads的失衡而出现，如通过Smad3的过度活化而Smad7的损失所显示。因此，鉴定特异性药剂以特异性地抑制Smad3活性同时增强Smad