抑制mcm蛋白复合物的方法和化合物及其在治疗癌症上的应用
【专利说明】抑制MCM蛋白复合物的方法和化合物及其在治疗癌症上的 应用 相关申请的交叉引用
[0001] 本专利申请与提交于2013年5月9日之国际专利合作条约专利申请（PATENT COOPERATION TREATY;序号为PCT/US2013/040287)以及提交于2012年5月9日之美国临 时专利申请（序号为61/644, 442)相关，其阐述的全部内容在这里作为参照引用。 发明领域：
[0002] 该发明的内容是有关用药物来抑制含有6个亚基的杂环状MCM蛋白复合体在癌细 胞DNA复制过程中的功能来治疗癌症，而且有关如何通过检测在候选药物处理过的细胞中 MCM蛋白亚基如hMcm2 and hMcm6的位置及其功能，筛选和鉴定出该类化合物。 发明背景
[0003] 癌细胞会失控般生长、分裂、侵蚀周围组织，并通过淋巴和血液循环系统可以侵入 或扩散到身体其他部分。常规的癌症治疗包括切除或摧毁癌细胞组织，例如，手术、化疗、放 疗、免疫疗法等。然后，所有疗法面临的共同挑战是如何在切底摧毁癌细胞的同时对正常细 胞和组织不造成严重的损害。近几十年来，化疗领域就一直关注于具有细胞毒的化合物的 研发与投入。大量的化合物被证明具有细胞毒及抗肿瘤功效。超过600000种的细胞毒化 合物中只有大约40种被认为具有一定的临床意义（Schwartsmann et al.，by 1988)。这 种较低成功筛选率的原因在于药物的毒性导致它们往往在有效抗癌剂量和毒性剂量之间 有着非常窄的治疗窗。这样以具有细胞毒的化合物为基础的抗肿瘤药物的筛选受到了很大 程度的限制，并且距离真正具有临床疗效还有较大的差距。所以现在我们需要的是对癌细 胞有更强大的特异性，也就是在抗肿瘤的同时不会对正常的细胞核组织造成巨大损害的药 物。 发明概述：
[0004] 本发明的目标即为：提供一种能够摧毁肿瘤细胞而对正常细胞和组织不会造成重 大损害的方法和药物。该方法是通过破坏MCM (minichromosome maintenance ;微染色体维 持蛋白）复合物的形成，该蛋白在复制前复合物（pre-replicative complex ;pre-RC)的组 装（此过程也称为复制许可）及DNA复制的延伸过程中起着关键的作用。DNA复制的起始 需要一系列的复制起始蛋白，以在每个复制原点上有序地形成复制前复合物。MCM复合物 的活性需要所有的六个MCM亚基（MCM2-MCM7)，以形成一个杂六元环，并在0RC1-6, N0C3， IPI1-3,⑶Tl，Cdc6和可能其他蛋白质的帮助下，被组装到复制起点上。作为AAA+ (ATPases associated with a variety of cellular activities;参与各种细胞活动 ATP 酶）家族 的成员蛋白，MCM复合物沿着复制叉移动，可能作为复制解旋酶，解开DNA双链。由于所有 的六个MCM亚基在DNA复制中所需要的，发明人的前期研宄公开于US Pat. Nos. 7393950和 8318922 (该专利在此作为参照引用），研宄表明：能够与MCM亚基特异结合的反义寡核苷酸 序列可以抑制细胞增殖。
[0005] 因为MCM蛋白的所有亚基要形成完整的环状才可以实现其功能，所以在中断杂六 聚体复合物的任何两个亚基之间的相互作用应该破坏MCM环结构，并灭活MCM复合物，抑制 DNA复制，并引起肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无影响。在本发明中，我们从植物提取物、组分 和化合物文库以及人工合成的化合物中筛选并确定了几个可以抑制人类MCM蛋白的相互 作用与活性，并阻断肿瘤细胞的DNA复制和细胞增殖的化合物。作为本发明的实施按例，我 们鉴定和发明的几个小分子可以破坏hMcm2和hMcm6之间的相互作用，削弱MCM蛋白的核 定位及其与染色质的结合，并抑制DNA复制。此外，这些化合物可以诱导肿瘤细胞凋亡而对 正常细胞没有明显的细胞毒性，并在裸鼠移植瘤模型中表现出强劲的抗肿瘤活性而对裸鼠 没有明显的毒副作用。
[0006] 这种特异性的根本原因是：正常细胞拥有能把细胞停滞在Gl期的检查系统，从 而避免细胞发生凋亡；而癌细胞缺乏此检查系统来控制这个过程，所以正常细胞能够识别 MCM蛋白结构是否完整，功能是否完善，只有当MCM在DNA复制过程中功能完善时，才能够进 入S期进行分裂，否则会暂停在Gl期，就像机动车辆会因为发现前方桥梁发生断裂而刹车； 而癌细胞会像刹车失灵的车辆因无法暂停而继续前行进入S期。
[0007] 该专利的另外一个保护内容是：我们建立了一个筛选抗癌药物的筛选平台，该筛 选平台能够筛选出对癌细胞有杀伤力而不影响正常细胞的药物。该方法的实现是通过验证 候选药物能否破坏MCM蛋白复合物的形成，使MCM的亚基被留在胞质中而不会被运往细胞 核而失去功能。
[0008] 该方法的步骤如下：1)将候选化合物加到细胞培养液中，处理细胞一定的时间； 2)检测上述细胞中有功能的MCM蛋白的水平，来实现对具有抗癌作用的化合物的筛选。检 测有功能的MCM蛋白的水平可通过检测MCM亚基在细胞核和细胞质当中分布的比例，因为 只有功能完整的蛋白复合体才能够存在于细胞核中，这样，化合物对MCM蛋白复合体形成 的破坏性越大，能在细胞核中定位的MCM亚基越少。检测MCM亚基在细胞中的分布可用间接 荧光检测的方法来实现，细胞经化合物处理后，带有荧光标记的二抗可识别结合了内源MCM 蛋白一抗，从而确定MCM蛋白在细胞中位置。另外也可通过方法荧光的直接观测：通过在细 胞中转染能够表达一个或多个融合了荧光蛋白的MCM亚基的质粒，例如hMcm2-GFP和/或 hMcm6-GFP，这样在化合物处理细胞后，融合了荧光蛋白的MCM亚基就可以被检测到。
[0009] 另外，也可通过BrdU核素掺入法、流式细胞仪等方法来检测DNA的复制来实现筛 选抗癌药物，同时，也可以通过其他步骤来检测除了破坏MCM结构外，该化合物是否在正常 细胞核癌细胞中具有不同的抑制细胞增殖的能力。
[0010] 该专利的另一目标是提供通过该机制抗肿瘤的高特异性化合物。具有该功能的化 合物一般具有如下结构规律：主结构I (4个环状的主体结构） 其中Rl是H或一到几个糖基；R2是B ( β )构型的5或6元环；R3和R4是H或OH ;R3 和R4也可以是一个0原子并与R3和R4相联的C原子形成一个3元环；R5是0H，R6是H，R5 和R6也可以是一个0原子并与R5和R6相联的C原子形成一个3兀环。
[0011] 目前专利中所保护的所有化合物和相关方法应用于对MCM蛋白的抑制药物敏感 的所有癌种，包括宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、急性髓细胞白血病、慢性淋巴 细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、胰腺癌、胃癌、皮肤 癌、膀胱癌、食道癌、鼻咽癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等。
[0012] 总结：该专利技术核心和保护重点是能够通过破坏MCM蛋白而选择性地摧毁癌细 胞的药物。
[0013] 作为本专利的一部分，关于此专利的各项创新点在保护内容中做了特别陈述。为 了使此专利内容更易于理解，本发明的操作优势、使用目的、参考内容等将在以下图文说明 中进一步阐述。 图例
[0014] 图1表明：本发明中该抗肿瘤化合物的结构（3-8)和不具有活性的同分异构体 (1-2)
[0015] 图 2 中 A :直接显微观察；B-H :WST_1 (water soluble tetrazolium-1)测量数 据；17 β -去乙酰海芒果素（17beta_Deacetyltanghinin ;见A-C)、17 β -黄花夹竹桃次戒 (17beta_Neriifolin;见 D)和 17β-去乙酰基海芒果素二醇（17beta_Deacetyltanghinin diol ;见E)是本专利申请中三个具有抗癌活性的化合物代表，这些药物对癌细胞具有较高 的选择性，而对正常细胞对性较低。对照药物紫杉醇（Paclitaxel ;Taxol ;见F)和依托泊 苷碳酸盐（VP16 ;见G和H)对正常细胞的毒性很强，对正常细胞和癌细胞的选择性较差。
[0016] 图3表明：通过免疫荧光的方法可以观察到17 β-去乙酰海芒果素合17 β-黄花 夹竹桃次甙可以破坏MCM亚基之间的结合，而17 β -去乙酰基海芒果素二醇的作用相对前 两者要弱。
[0017] 图4表明：通过免疫荧光的方法可以观察到17 β-去乙酰海芒果素、17 β-黄花夹 竹桃次甙和17 β -去乙酰基海芒果素二醇都可以破坏hMcm2和hMcm6在细胞核中的定位。
[0018] 图5表明：染色质免疫沉淀实验和流式细胞仪方法表明：17β-去乙酰海芒果素能 够抑制复制前复合物（pre-RC)组装，导致癌细胞的凋亡。
[0019] 图6表明：流式细胞仪方法可以观察到：17 β -去乙酰海芒果素能够抑制DNA的复 制，引导癌细胞的凋亡。
[0020] 图7表明：通过BrdU核素掺入法可以观察到17 β -去乙酰海芒果素能够抑制DNA 的复制。
[0021] 图8表明：流式细胞仪和膜联蛋白V染色的方法可以观察到：17β_去乙酰海芒果 素、17-黄花夹竹桃次甙和17-去乙酰基海芒果素二醇都可以导致癌细胞的凋亡。
[0022] 图9表明：通过WST-I的方法检测到：用17 β-去乙酰海芒果素处理细胞，然后除 去该药物，正常细胞可以恢复生长，而癌细胞不能。
[0023] 图10表明：在裸鼠中可以观察到17 β-去乙酰海芒果素的抗肿瘤作用。
[0024] 图11表明：在图10所示的实验中，17 β -去乙酰海芒果素对裸鼠无明显毒性。 本发明的具体实施方案的详述 会田胞系和!质粒
[0025] 人MCM6和MCM2 cDNA片段分别克隆到pEGFP-C3 (Invitrogen公司）以用于细胞 内的定位检测。HeLa细胞（宫颈腺癌）、HK1 (鼻咽癌）、C666-1 (鼻咽癌）、!fepG2细胞（肝 癌）和H印3B细胞（肝癌），在含有10%的胎牛血清（FBS)的DMEM培养基中培养。L-02细 胞（人正常肝细胞，来源于中国科学院上海生命科学院生物化学及细胞研宄所）则培养在 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中。NP460 细胞培养在附加了 S0125(Cascade Biologies 公 司）的 1:1 Keratinocyte_SFM(Invitrogen 公司）and MEPI500CA 培养基中。所有的细胞 系均在37, 5%的二氧化碳的培养箱中培养。 抗増葙活件测宙
[0026] 为了测试药物对人细胞系的影响及计算对各个细胞系的半致死剂量（IC5tl)，HepG2 细胞，HeLa细胞和H印3B细胞（约4X 105个细胞/孔）等肿瘤细胞和人正常肝细胞 L-02 (约5X 105细胞/孔），分别接种于96孔板，并在100微升培养基中和在37下温育至 少12小时。然后用2倍梯