使用噬菌体溶素的生物膜预防、破坏和处理的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般地涉及用溶素、特别是具有杀死葡萄球菌属细菌(包括抗药金黄色葡 萄球菌）的能力的溶素、尤其是溶素PlySs2阻止、控制、破坏和处理细菌生物膜。本发明也 涉及用于调节细菌一种或多种生物膜和生物膜形成的组合物和方法。
【背景技术】
[0002] 随着更多的抗生素被用于多种疾病和其它病症，抗药细菌的发展成为医学领域中 的一个重大问题。更多抗生素的使用和显示抗性的细菌的数目已经提示更长的治疗时间。 此外，广泛的非特异性的抗生素目前正被更频繁地使用，其中一些对患者具有有害作用。一 个与该增加的使用有关的问题是，许多抗生素不容易渗入粘膜衬里。
[0003] 革兰氏阳性细菌被含有多肽和多糖的细胞壁包围。革兰氏阳性细菌包括、但不 限于放线菌属芽孢杆菌属（ifeciBys)、李斯特菌属（Zisteria)、乳球菌 属（Zac(ococctts)、葡萄球菌属（、链球菌属（Stre/? (ococctts)、肠球菌属 (/? 、分枝杆菌属（IcoAac、棒杆菌属（和梭菌属 (C7(〇stri￡/iw?)。医学相关的物种包括酿脓链球菌（肺炎链球 菌（金黄色葡萄球菌（和奠肠球菌 (Aflterococcy1S/aeca/is)。产芽孢的芽孢杆菌属种引起炭疽和胃肠炎。产芽孢的梭菌属 种负责肉毒中毒、破伤风、气性坏疽和假膜性结肠炎。棒杆菌属种引起白喉，并且李斯特菌 属种引起脑膜炎。
[0004] 新颖的抗微生物治疗方案包括基于酶的抗生素("酶抗生素")诸如噬菌体溶素。噬 菌体使用这些溶素消化其细菌宿主的细胞壁，通过低渗裂解释放子代病毒。当将纯化的重 组溶素从外部加给革兰氏阳性细菌时，产生的相似结果。溶素针对革兰氏阳性病原体的高 致死活性使得其成为开发为治疗剂的有吸引力的候选物（Fischetti，V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400; Nelson, D. L?等人（2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。噬菌体溶素最初提出用于根除病原性链球菌的鼻咽携带（Loeffler，J. M?等人（2001) Science 294: 2170-2172; Nelson, D?等人（2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。溶素是由双链DNA (dsDNA)噬菌体使用的使宿主裂解与病毒装配完 成协调的裂解机制的部分（Wang, I. N?等人（2000) AnnuRevMicrobiol 54:799-825)。 溶素是这样的肽聚糖水解酶：其破坏细菌壁中的键，快速地水解肽聚糖完整性所需的共价 键，引起细菌裂解和伴随的子代噬菌体释放。
[0005] 溶素家族成员显示出其中催化结构域与特异性或结合结构域融合的模块设计 (Lopez, R?等人（1997) Microb Drug Resist 3:199-211)。可以从细菌基因组内的 病毒原噬菌体序列克隆溶素并且将其用于治疗（Beres，S.B.等人（2007) PLoSONE 2(8):1-14)。当从外部加入时，溶素能够接近革兰氏阳性细胞壁的键（Fischetti，V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400)。菌体裂解酶已被确定为通过多个施用 途径在对象的不同类型的感染的评价和特异性治疗中是有用的。例如，美国专利5, 604, 109 (Fischetti等人）涉及通过经由半纯化的C组链球菌噬菌体相关溶素酶的酶促消化，在临 床样本中的A组链球菌的快速检测。该酶工作变成另外研宄的基础，导致治疗疾病的方法。 Fischetti 和 Loomis 专利（美国专利 5, 985, 271、6, 017, 528 和 6, 056, 955)公开了通过由 Cl噬菌体感染的C组链球菌细菌产生的溶素酶的用途。美国专利6, 248, 324 (Fischetti和 Loomis)公开了通过使用在适合于局部应用于皮肤组织的载体中的裂解酶用于皮肤病学感 染的组合物。美国专利6, 254, 866 (Fischetti和Loomis)公开了用于治疗消化道的细菌 感染的方法，其包括施用对感染细菌特异性的裂解酶。用于将至少一种裂解酶递送至消化 道的载体选自栓剂灌肠剂、糖浆剂或具有肠溶衣的丸剂。美国专利6, 264, 945 (Fischetti 和Loomis)公开了用于治疗细菌感染的方法和组合物，通过胃肠外引入(肌内、皮下或静脉 内）至少一种裂解酶和用于将所述裂解酶递送进患者的合适载体，所述裂解酶由对该细菌 特异性的噬菌体感染的细菌产生。
[0006] 噬菌体相关裂解酶已经得到鉴别且从多种噬菌体中克隆，每种被证实可有效地杀 死特定细菌菌株。美国专利7, 402, 309、7, 638, 600和公开的PCT申请W02008/018854提 供了可用作用于治疗或减少炭疽芽孢杆菌（AaciVAz1S 感染的抗细菌剂的独特 噬菌体相关裂解酶。美国专利7, 569, 223描述了用于肺炎链球菌的裂解酶。在美国专利 7, 582291中描述了对于肠球菌属(奠肠球菌（万./aeca/is)和屎肠球菌（凡/aecitt?)，包括 万古霉素抗性菌株）有用的溶素。US 2008/0221035描述了非常有效地杀死B组链球菌的 突变体Ply GBS溶素。在W02010/002959中详述了具有针对葡萄球菌属细菌(包括金黄色 葡萄球菌)的活性且命名为ClyS的嵌合溶素。ClyS对葡萄球菌属细菌是特异性的，且对链 球菌属和其它革兰氏阳性细菌是无活性的。
[0007] 基于它们的快速的、有效的且特异性的细胞壁降解性能和杀细菌性能，已经提议 溶素作为抗微生物治疗剂，通过从细胞外面攻击暴露的肽聚糖细胞壁来斗争革兰氏阳性病 原体（Fenton, M等人（2010) Bioengineered Bugs 1:9-16; Nelson, D等人（2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。已经在咽炎（Nelson, D等人（2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)、肺炎（Witzenrath, M等人（2009) Crit Care Med 37:642-649)、 中耳炎（McCullers, J. A?等人（2007) PLOS pathogens 3:0001-0003)、胺肿（Pastagia， M 等人 Antimicrobial agents and chemotherapy 55:738-744)、菌血症（Loeffler，J. M. 等人（2003)感染 and Immunity 71:6199-6204)、心内膜炎（Entenza, J. M?等人（2005) Antimicrobial agents and chemotherapy 49:4789-4792)和脑膜炎（Grandgirard, D 等 人（2008) J Infect Dis 197:1519-1522)的啮齿动物模型中证实了不同溶素作为单一药 剂的效力。另外，溶素通常对它们的细菌宿主物种是特异性的，并且不会裂解非靶生物体， 包括对胃肠体内稳态可能有益的人共生细菌（Blaser，M. (2011) Nature 476:393-394; Willing, B. P?等人（2011) Nature reviews. Microbiology 9:233-243)。
[0008] 微生物倾向于形成附着于表面的生物膜群落，作为在不同环境中的一个重要存 活策略。生物膜由微生物细胞和多种自身产生的细胞外聚合物质（包括多糖、核酸和蛋 白）组成（Flemming HC 等人（2007) J Bacteriol 189:7945-7947)。生物膜存在于天 然和工业水生环境、组织和医学材料和装置中（Costerton JW等人（1994) J Bacteriol 176:2137-2142)。尽管大多数天然生物膜由多种细菌物种形成，生物膜可以由单一细菌菌 株形成（Yang L等人（2011) Int J Oral Sci 3:74-81)。由于它们的独特生理学和物理基 质屏障，抗生素的施用经常对于生物膜群体而言是无效的。
[0009] 葡萄球菌经常形成生物膜，即被包围在细胞外基质中的固着群落，其附着于生物 医学植入物或受损伤的和健康的组织。与生物膜有关的感染难以治疗，并且据估测，生物 膜中的固着细菌对抗生素的抗性是它们的浮游的相应物的1，000-1，500倍。生物膜的这 种抗生素抗性经常导致常规抗生素疗法的失败，且需要除去被感染的装置。已经证实溶葡 萄球菌酶会杀死生物膜中的金黄色葡萄球菌，并且还在体外破坏塑料和玻璃表面上的金黄 色葡萄球菌生物膜的细胞外基质（Wu, JA等人（2003) Antimicrob Agents and Chemoth 47(11) :3407-3414)。金黄色葡萄球菌生物膜的这种破坏是对溶葡萄球菌酶敏感的金黄色 葡萄球菌特异性的，且不会影响溶葡萄球菌酶抗性的金黄色葡萄球菌的生物膜。即使在24 h以后，高浓度的苯挫西林（400Mg/ml)、万古霉素（800Mg/ml)和克林霉素（800Mg/ml)对建 立的金黄色葡萄球菌生物膜没有影响。溶葡萄球菌酶也会破坏表皮葡萄球菌生物膜，但是， 需要更高的浓度。已经报道了噬菌体溶素用于除去葡萄球菌生物膜的应用，具有混合的结 果。据报道，噬菌体溶素SAL-2会除去金黄色葡萄球菌生物膜（Son JS等人（2010) Appl Microbiol Biotechnol 86 (5) : 1439-1449)，而在 2 种类似的菌体溶素 phill 和 phil2 的 情况下，尽管phill水解葡萄球菌生物膜，但是phil2是无活性的（Sass P和Bierbaum G (2007) Appl Environ Microbiol 73(1) :347-352)。针对不同系统中的细菌生物膜的除去 和消毒，已经研宄了所述酶的多种组合（Johansen C等人（1997) Appl Environ Microbiol 63:3724-3728)。但是，该方法需要最小量的2种酶或试剂，一种酶或试剂用于除去生物膜 的粘附细菌，第二种酶或试剂具有杀细菌活性。
[0010] 从与目前常规抗细菌剂相关的缺陷和问题显而易见，本领域仍需要另外的特异性 细菌试剂和治疗模态以及更广谱的试剂，特别是在没有获得性抗性的风险下，用于有效力 地和有效率