针对血栓形成过程中胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的纳米抑制剂及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及针对血栓形成过程中胶原蛋白与整联蛋白a2M相互作用的纳米抑 制剂及制备方法和应用，属于生物材料中的药物载体设计和医学中的血栓症的治疗研宄领 域。
【背景技术】
[0002] 血栓性疾病严重危害人类的健康和生命安全，据世界卫生组织统计，在全球范围 内，血栓性疾病的发病率居高不下，并且在发展中国家呈现出逐年增加的趋势。其中，常见 的血栓性疾病如急性心肌梗死、脑梗死和缺血性中风导致的死亡和残疾占据极大比例，对 人类社会的经济和社会发展造成极大负面影响。动脉血栓的形成是由于血管内壁发生病变 破损，造成血管内皮下组织纤维物暴露于血浆之中，激活血小板诱发血液凝集形成血凝块 阻塞血管，导致血液循环流动受阻，甚至完全中断，危及人类的生命健康。血栓形成包括血 小板在破损血管内壁处的初始粘附、血小板的稳定吸附以及血小板聚集三个重要过程。目 前，市面上采用的血栓防治类药物多以血小板为靶向物，例如，阿司匹林（Aspirin)、利多格 雷（Ridogrel)、噻氯匹啶（Ticlopidine)等，这类药物通过不可逆抑制血小板表面受体激 活的关键代谢途径的酶活，以降低血小板的活力，达到抑制血栓形成的目的，但同时也破坏 人体的正常凝血与抗凝血的平衡，存在引发大规模出血的风险，有着很大的副作用。因此， 开发疗效显著、副作用小的血栓防治药物已经成为医学界研宄的热点，具有重要意义。
[0003] 血小板表面的整联蛋白a2M与胶原蛋白结合对血小板在破损血管壁处的稳定 吸附有着至关重要的作用。研宄报道整联蛋白a2M的过量表达将导致血栓的形成，而表 达缺陷型仅仅会轻微延长出血时间，并不会导致严重的出血不止的问题。因此，以胶原蛋 白为靶向物，通过阻隔血小板表面的整联蛋白a2M与破损血管壁处暴露的胶原蛋白结 合，是一条有效的抑制血栓形成的手段，并且有助于减小大规模出血的风险。多肽抑制剂 LffffNSYY基于整联蛋白a2M与胶原蛋白结合的关键残基设计筛选而来，被证实能有效的 吸附在胶原蛋白表面，阻隔整联蛋白a2M与胶原蛋白结合从而抑制后续的血栓形成，但 由于其较强的疏水性导致LffffNSYY分子多聚形成分子团簇，严重影响药物在生理条件下效 能的发挥。因此，改善多肽抑制剂在生理环境下的溶解度和分散性对于药物效能的提升有 着重要意义。
[0004] 将疏水药物与大分子或者纳米颗粒偶联，通过固定化的方法改善其在水相中的溶 解度和分散性被广泛证实是一条有效途径。甲基丙烯酸缩水甘油酯（GM)由于其较好的生 物相容性和丰富的表面活性基团，被广泛应用于药物修饰和载体输送的研宄中，是一个优 良的药物载体。因此，将多肽抑制剂固定在GM单体聚合形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯 (PGM)纳米颗粒的表面是一条提升其水溶性和分散性的有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提出针对血栓形成过程中胶原蛋白-整联蛋白a2M相互作用 的纳米抑制剂及制备方法和应用，所得纳米抑制剂是首次提出并经验证是有效的。多肽血 栓抑制剂LffffNSYY被证实能有效抑制胶原蛋白与整联蛋白a2M结合从而抑制后续的血 栓形成，但是其较强的疏水性导致其在生理环境多聚形成分子团簇，严重影响其药物效能 的发挥。通过将多肽抑制剂固定于PGM纳米颗粒表面制备获得纳米抑制剂LPN，可有效提 升多肽抑制剂在水溶液的溶解度和分散度。等温滴定量热实验、血小板吸附实验和大鼠体 内血栓实验证实该纳米抑制剂LPN相比原多肽抑制剂LffffNSYY能够更好抑制血栓形成，是 更加高效的血栓抑制剂。
[0006] 本发明的纳米抑制剂制备技术方案概述如下：
[0007] 本发明提出的纳米抑制剂结构上分为两个部分，一个部分是由甲基丙烯酸缩水 甘油酯聚合形成的粒径在80~120nm范围内的PGM纳米球，另一部分是固定在PGM纳 米球表面的发挥药物效能的多肽抑制剂LWWNSYY。我们将制备获得的纳米抑制剂命名为 LPN(LffffNSYY-PGMAnanoparticles)〇
[0008] 本发明提出的纳米抑制剂LPN制备合成路线如下：
[0009] (1)通过甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA)聚合形成基质PGMA纳米球；
[0010] (2)将获得的PGM纳米球将表面的环氧基开环；
[0011] (3)通过加入环氧氯丙烷，在PGM纳米球表面再次修饰上环氧基；
[0012] (4)通过环氧基与多肽抑制剂LffffNSYY的N末端氨基在碱性条件下反应，实现多肽 抑制剂在PGM纳米球表面的固定，制备获得纳米抑制剂LPN。
[0013] 具体优选各个步骤如下，但不局限于此，凡是达到本发明目的的方法，都使用本发 明。
[0014] 所述步骤（1)的方法如下：
[0015] 在锥形瓶中，加入5~15% (v/v)甲基丙烯酸缩水甘油酯（GM)单体，0. 1~0. 5% (v/v)乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA)，5 ~15% (v/v)浓度为 30~IOOmM的Na2C03/NaHC03 缓冲液，5~15% (v/v)浓度为1~5% (w/w)KPS溶液，0. 01~1% (w/w)十二烷基硫酸钠 (SDS)，70~90% (v/v)过膜去离子水；随后向锥形瓶鼓入氮气，排净溶液中的氧气，持续 10~20min，然后密封瓶口；随后将加有反应物的锥形瓶置于空气浴摇床上，90~llOrpm， 20~30°C条件下乳化15~25min。乳化完成后将锥形瓶转移到水浴摇床上，160~200rpm， 65~75°C条件下反应12~14h。将反应结束后的悬液装入透析袋（截留分子量8000~ 14000)于室温下蒸馏水环境中透析3~5天，每天换透析液3~5次，获得纯净的PGMA纳 米球。
[0016] 所述步骤⑵的方法如下：
[0017] 于锥形瓶中加入20~50% (v/v)的PGMA纳米球悬浮液，加入50~80% (v/v) 浓度为〇. 3~IM的硫酸溶液，55~65°C水浴，160~200rpm反应2~5h，打开PGMA纳米 球表面的环氧基；然后用步骤（1)所述透析方法，除去其中过量的硫酸分子，得到纯净的环 氧基被开环的PGMA-OH纳米球。
[0018] 所述步骤⑶的方法如下：
[0019] 于锥形瓶中加入20~50% (v/v)的PGMA-OH纳米球悬浮液于锥形瓶中，依次加入 20~30%(v/v)二甲基亚砜，10~15%(v/v)环氧氯丙烷，20~30%(v/v) NaOH(浓度为 0. 5~2M)，150~200rpm，20~30°C条件下反应2~4h;反应后通过步骤（1)所述透析方 法除去过量的小分子，并在透析完成后用聚乙二醇20000进行浓缩；获得纯净的表面修饰 有环氧基的PGM-ECH纳米球。
[0020] 所述步骤（4)的方法如下：
[0021] 于锥形瓶中加入20~50% (v/v)的PGMA-ECH纳米球悬浮液，加入0.01~2% (w/w)多肽抑制剂LWWNSYY，再加入 50 ~80% (v/v)的NaHC03(0. 1 ~1M)溶液，20 ~30°C 水浴，150~200rpm反应10~14h，随后加入NaBH4 (控制终浓度为0. 05~1M)反应10~ 14h。反应结束后取出，用步骤（1)所述透析方法除去体系里的小分子，用聚乙二醇20000 浓缩，获得粒径80~120nm的纳米血栓抑制剂LPN，纳米血栓抑制剂LPN在透射电镜下呈现 出规整的球形；如图2所示。
[0022] 本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血小板与胶原蛋白吸附方面的应用。
[0023] 本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血栓形成大小方面的应用。
[0024] 本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血栓形成速度方面的应用。
[0025] 本发明的纳米抑制剂LPN作为血栓防治药物和保健品方面的用途。
[0026] 本发明的有益效果：通过将多肽抑制剂LffffNSYY固定在PGM纳米颗粒的表面制备 获得的纳米抑制剂LPN能有效克服多肽抑制剂由于较强的疏水性造成的分子多聚，从而改 善多肽抑制剂在生理环境下的水溶性和分散度。由此使得纳米抑制剂表面固定的多肽抑制 剂分子的有效亲和位点在生理条件下能够自由暴露，在等温滴定量热实验中实现与胶原蛋 白在生理环境规律结合，并且对抑制血小板与胶原蛋白