protein I)及 ESAT-6。
[0068]图2e是对Ag85A、HspX, ESAT-6及38_kDa的免疫促进功能进行比较的实验结果。图2e中利用了 CIA05 0.5 μ g及各个抗原2 μ g。
[0069]图3是对本发明的炭疽疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0070]图4是对本发明的A型肝炎疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0071]图5是对本发明的B型肝炎疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0072]图6是对本发明的C型肝炎疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0073]图7是对本发明的HIV疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0074]图8是对本发明的流感疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0075]图9a?图9b是对本发明的HSV-2 (Herpes simplex virus type 2)疫苗的功效进行分析的实验结果。图9a及图9b中，作为各个抗原，利用了 gD抗原及gB抗原。
[0076]图9c是对gD抗原及gB抗原的免疫促进功能进行比较的实验结果。图9c中利用了 CIA05 0.5 μ g及各个抗原2 μ g。
[0077]图10是对本发明的Hib (Haemophilus influenzae type b)疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0078]图11是对本发明的脑膜炎奈瑟菌疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0079]图12a?图12c是对本发明的DPT疫苗的功效进行分析的实验结果。图12a?图12c中，作为各个抗原，分别利用了白喉毒素、百日咳毒素及破伤风毒素。
[0080]图12d是对白喉毒素、百日咳毒素及破伤风毒素的免疫促进功能进行比较的实验结果。图12d中，利用了 CIA05 0.5yg及各个抗原2yg。
[0081]图13是对本发明的水痘疫苗疫苗的功效进行分析的实验结果。
[0082]图14a是在小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs，Bone marrow-derived dendriticcells)中，分析对树突状细胞的成熟化的CIA05(实施例1中制备的免疫佐剂)的功效的结果O
[0083]图14b是在人单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs，Monocyte-derived dendriticcells)中，分析对树突状细胞的成熟化的CIA05(实施例1中制备的免疫佐剂)的功效的结果O
[0084]【实施方式】
[0085]以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅是为了对本发明进行更加详细的说明，根据本发明的主旨，本发明请求保护的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
[0086]【实施例1:作为新免疫佐剂的非常短的脂寡糖(LOS)CIA05的生产】
[0087]本发明者已经从生存在健康的人的肠道中的大肠杆菌中发掘了具有脂寡糖的糖链的长度非常短的脂多糖的菌株(E.coli EG0021)，并于2002年5月2日，将此菌株寄托于寄托机构一韩国微生物保管中心，并获得了寄托编号KCCM10374(参照:韩国专利授权第 0456681 号；W02004/039413 ;韩国专利授权第 0740237 号；W02006/121232)。从上述菌株的脂多糖的纯化是根据韩国专利授权第0456681号；W02004/039413 ;韩国专利授权第0740237号；W02006/121232中公开的方法来实施的。利用MALD1-MASS (Shimadz公司，Axima-LNRV 2.3.5 (Mode Liner, Power: 106))来测定纯化的脂多糖的分子量，测定结果，确认了具有约3千5百Da的分子量。纯化的脂多糖根据韩国专利授权第0456681号；W02004/039413 ;韩国专利授权第0740237号；W02006/121232中公开的方法，根据公开的实验方案进行了脱毒化。简单地，在3mg/ml的上述纯化的脂多糖中，以1:1的量混合2N NaOH后，在60°C下每隔10分钟振荡一次，如此进行140分钟脱酰基化，投入初期0.2N NaOH量的约1/5左右的IN乙酸，来滴定至pH7.0o在pH滴定后，进行乙醇沉淀，从而获得非毒性脂寡糖(CIA05)ο
[0088]【实施例2:新免疫佐剂CIA05和现有免疫佐剂单磷酸脂质A之间的毒性比较实验】
[0089]对本发明的疫苗中用作免疫佐剂的上述实施例中所制备的CIA05和现有的宫颈癌疫苗中所使用的单磷酸脂质A的毒性进行了比较分析。接收健康的人的血液，来分离外周血单核细胞(PBMC，Peripheral Blood Mononuclear Cell)，在24孔培养皿中以5X105cell/ml的浓度培养上述外周血单核细胞。此时，使用在RPMI1640 (Gibco公司)中混合10%的胎牛血清(FBS，fetal calf serum ;Gibco公司)而得的培养液，而每个孔的容量均分为lml。以如下条件分别处理了准备好的培养皿。I)阴性对照组:平衡盐溶液(BBS，Balanced salt solut1n) 100 μ I ；2)脱酰基化非毒性脂寡糖(CIA05) 10 μ g/100 μ 1:3)单磷酸脂质 A(E.coli F583MPL) 10 μ g/100 μ I。
[0090]经过12小时之后，收集已处理的培养液进行离心分离，并利用酶联免疫吸附测定方法(ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(R&Dsystem公司，DY210)对急性单核细胞白血病(THP-1，Acute monocytic leukemia)中分泌的作为炎性蛋白的肿瘤坏死因子的量分别进行测定。实验结果表明，如图1所示，毒性比以往用作疫苗佐剂的单磷酸脂质Α，大约少1/3左右。
[0091]【实施例3:本发明的结核疫苗的功效分析】
[0092]【结核疫苗抗原和免疫佐剂CIA05的免疫】
[0093]为了在结核疫苗中确认免疫佐剂CIA05的功效，使用了结核菌株(Mycobacteriumtuberculosis)的 4 种抗原。这 4 种抗原为 Ag85A(32-kDa)、HspX(16-kDa)、Phosphatebinding protein I (38-kDa)及 ESAT-6 (6_kDa)。分别混合每 2 μ g 的上述 4 种抗原，每隔一周向6周龄的Balb/c小鼠(SLC，日本)注射3次。此时，单独注射抗原或者包含Alum(氢氧化铝；Brenntag公司，德国)100 μ g或CIA050.5 μ g，以最终体积为100 μ I来进行注射。
[0094]【结核疫苗抗原的特意血清抗体的滴定】
[0095]为了测定免疫后的血清内结核抗原的特意抗体滴度，使用了终点稀释酶联免疫吸附测定(ELSIA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)方法。以 lyg/ml 的浓度向 96孔板分别涂敷(4°C, 一夜)100 μ I 的 Ag85A (32-kDa)、HspX (16-kDa)、Phosphate bindingprotein I (38-kDa)及 ESAT-6 (6_kDa)后，利用 I %牛血清白蛋白(B SA, bovine serumalbumin) 300 μ g来封闭(常温，I小时)。封闭之后，利用包含0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBS，Phosphate-Buffered Saline)清洗3次，并将免疫后所获得的血清100 μ I进行反应(37°C，2小时)。为了确认结合抗原的特意抗体，将辣根过氧化物酶-共轭物抗-小鼠IgG(Zymed)进行反应后，添加四甲基联苯胺(TMB，tetramethylbenzidine，BD生物科学公司，55555214)，并利用IN H2SO4终止反应。实验结果，在450nm测定吸光度，从而确认了免疫后回收的血清内结核抗原的特意抗体的量。
[0096]【结核疫苗中的免疫佐剂CIA05的功效分析】
[0097]对结核菌株的4种抗原和免疫佐剂CIA05的功效进行分析的结果，在Ag85A (32-kDa)抗原的情况下，利用Alum的实验组与单独使用抗原的实验组相比，增进大约4倍(Alum 50 μ g)或大约8倍(Alum 100 μ g)左右增加的结核抗原_特意抗体的生成，在利用CIA05的情况下，与单独使用抗原的实验组相比，增进大约16倍(CIA05 0.5 μ g)或大约128倍(CIA05 I μ g)左右增加的结核抗原-特意抗体的生成(图2a)。并且，在利用CIA05的情况下，结核抗原-特意抗体产量对给药剂量依赖性地剧增，从而能够了解CIA05对结核抗原Ag85A是非常适合的免疫佐剂。一方面，作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用0.5 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum 100 μ g)。作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用1.0 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum 100 μ g)
[0098]在HspX(16-kDa)抗原中，利用Alum的实验组与单独使用抗原的实验组相比，增进大约4倍(Alum 50 μ g)或大约8倍(Alum 100 μ g)左右增加的结核抗原_特意抗体的生成，在利用CIA05的情况下，与单独使用抗原的实验组相比，增进大约16倍(CIA05 0.5 μ g)或大约128倍(CIA05 Iyg)左右增加的结核抗原-特意抗体的生成(图2b)。并且，在利用CIA05的情况下，结核抗原-特意抗体产量对给药剂量依赖性地剧增，从而能够了解CIA05对结核抗原HspX(16-kDa)是非常适合的免疫佐剂。一方面，作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用0.5 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum 100 μ g)。作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用1.0 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum 100 μg)。
[0099]对于Phosphate binding protein I (38-kDa)抗原而言，利用 Alum 的实验组与单独使用抗原的实验组相比，增进大约4倍(Alum 50 μ g)或大约8倍(Alum 100 μ g)左右增加的结核抗原-特意抗体的生成，在利用CIA05的情况下，与单独使用抗原的实验组相比，增进大约8倍(CIA05 0.5 μ g)或大约64倍(CIA05 I μ g)左右增加的结核抗原-特意抗体的生成(图2c)。并且，在利用CIA05的情况下，结核抗原-特意抗体产量对给药剂量依赖性地剧增，从而能够了解CIA05对结核抗原Phosphate binding protein I (38-kDa)是非常适合的免疫佐剂。一方面，作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用0.5 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum100 μ g)。作为免疫佐剂，将CIA05和Alum同时使用的情况下，比起只使用1.0 μ g的CIA05的情况，抗体产量增加大约2倍(Alum 50 μ g)或大约4倍(Alum 100 μ g)。
[0100]对于ESAT-6 (6-kDa)抗原而言，利用Alum的实验组与单独使用抗原的实验组相比，增进大约4倍(Alum 50 μ g)或大约8倍(Alum 100 μ g)左右增加的结核抗原_特意抗体的生成，在利用CIA05的情况下，与单独使用抗原的实验组相比，增进大约16倍(CIA05
0.5 μ g)或大约128倍(CIA051 μ g)左右增加的结核抗原-特意抗体的生成(图2d)。并且，在利用CIA05的情况下，结核抗原-特意抗体产量对给