组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法及其活体应用
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及功能纳米材料和生物化学领域，具体涉及组氨酸多肽对上转换纳米颗 粒进行相转移以及蛋白酶活体成像，本发明通过组氨酸多肽对上转换纳米颗粒的相转移反 应，获得均一、稳定、并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，再用蛋白酶对荧光 标记的组氨酸多肽上转换纳米颗粒进行酶切反应，用所得的上转换纳米颗粒的荧光恢复作 为信号，进行活体显影成像，根据显影的强弱来反映蛋白酶活性浓度的变化。
【背景技术】
[0003] 上转换纳米颗粒在近红外（980 nm或808 nm)被激发，发射出可调节的可见光(根 据掺杂元素的不同，上转换纳米颗粒发射波长范围是可调的)。相比于传统的下转换材料比 如量子点、荧光染料，上转换具有多色可调性、没有光漂白、深层成像、优异的信噪比、低毒 性这些优势使它在应用过程中避免了生物体的自体荧光的干扰。从而能够被广泛的应用在 生物成像、药物释放、细胞成像、酶检测、肿瘤靶向等生物纳米医学领域。然而制备水溶性、 单分散、稳定、具有生物活性的上转换纳米颗粒仍然是具有挑战的。为了克服这个问题，科 学家们想了很多办法来解决，比如说：一步热溶剂合成、配体交个、配体加成、硅壳、配体氧 化等等。但是这些方法都有一个缺点一转化效率低下，并且需要进一步反应来链接生物分 子使上转换纳米颗粒具有生物活性。日前有报道说：DNA修饰的上转换纳米颗粒，利用DNA 中的磷酸基团与稀土元素耦合从而取代油相配体，但是DNA修饰的上转换颗粒容易积聚， 修饰上DNA的上转换纳米颗粒转需要过0. 22 μ m的微孔滤膜，滤去大的沉淀颗粒。这样上 转换纳米颗粒转相的效率就下降了，从而荧光强度就下降，在生物体内的应用范围就受到 了一定的限制。因此，如何制备一种高效的、高稳定、均匀分散并具有生物活性的水溶性上 转换纳米颗粒成为本发明研宄的课题之一。
[0004] 蛋白酶对蛋白质和多肽底物的特异性催化水解反应，对于生物体的正常生命活动 发挥着极其重要的作用。检测酶含量及存在，很难直接用酶的量(例如质量、体积、浓度）来 表示，而常用酶催化某一特定化学反应的能力来表示酶量，即用酶活性来表示。研宄表明， 蛋白酶活性的失调能够引起疾病，如癌症，炎症、退化性疾病等，这已经引起了科学家的广 泛关注，因此在研宄中需要检测蛋白酶的活性，检测蛋白酶的活性在蛋白酶活性相关疾病 的医学诊断和工业生产方面都具有十分重要的意义。传统的酶活性检测方法，如免疫荧光 吸附方法（简称ELISA) ,Tothill提出免疫荧光吸附方法；Lamore S. D.提出虽然质谱和 凝胶电泳方法；Lee J. S.等的研宄表明荧光共振能量转移方法，虽然都可以检测蛋白酶活 性，但是仅仅只是应用于体外，对于活体内部仍然没有一个可行的方案。因此，如何设计一 种高效的、方便快捷、成本低的新型活体内蛋白酶活性检测方法成为本发明研宄的又一课 题。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供了一种以组氨酸多肽对上转换纳米颗粒进行相转移的方法，该 方法能够非常简单的一步制备出高稳定性、均一、单分散、转化效率接近100%的水溶性并 具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，同时，转到水相的上转换纳米颗粒不聚集、 均匀分散，并且具有上转换发光的能力，而上转换纳米颗粒表面的多肽仍然具有生物活性。 本发明解决了目前水相中上转换纳米颗粒聚集、以及转相效率低的问题。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法方案 是：所述方法由下列步骤组成： 第一步，设计一段含有组氨酸的多肽； 所述含有组氨酸的多肽为一段由2~50个氨基酸构成的肽链，其中组氨酸的个数所占 的百分比为15~100% ;从亲水性上，所述肽链为水溶性，并且HLB > 10 ;在带电荷情况上，所 述肽链具有正电荷或零电荷或负电荷；所述组氨酸位于所述肽链的氨基端，或位于所述肽 链的羧基端，或位于所述肽链的中间，或位于所述肽链的两端；所述肽链在其氨基酸或者在 羧基端标记焚光分子；所述焚光分子的吸收峰在上转换纳米颗粒发射峰-50 nm~50 nm处， 所述荧光分子选自四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素、菁染料琥珀酰亚胺酯3、菁染料琥珀酰 亚胺酯5. 5、2, 5-二特丁基对苯二酚中的任意一种； 第二步，用所述第一步设计的含有组氨酸的多肽对上转换纳米颗粒进行转相，得到水 相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒； 所述上转换纳米颗粒由主体材料和掺杂材料组成，主体材料在上转换纳米颗粒中的 摩尔浓度为50~99%，剩余部分为所述掺杂材料，其中，所述主体材料为NaREF4、KYF4、YV0 4、 LaF3、Y203、CaF2、BaTi0 3、Lu203、La203、BaGdF 5、BaF2中的任意一种，所述 RE 为 Y、Yb、Pr、NcU Dy、GcU Lu中的任意一种；所述掺杂材料由敏化剂和激活剂组成，所述敏化剂为NcU Yb、Tb、 Gd、Lu中的任意一种，所述激活剂为Er、Tm、Ho、Sm、Dy、Tb、Eu中的任意一种；所述上转换 纳米颗粒的表面配体选自油酸、油胺、1-十八(碳）烯中的至少一种； 所述转相为油相和水相；所述油相的溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、一氯甲烷、环己烷、 苯、甲苯、二甲苯戊烷、己烷、辛烷环己酮、甲苯环己酮等、氯苯、二氯苯、环氧丙烷、乙酸乙 酯、乙酸丙酯、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚、吡啶、苯酚中的任意一 种；所述水相的溶剂为水或水的缓冲液；所述水的缓冲液是指pH在5 ~ 10之间的缓冲溶 液； 所述转相是指在温度为0°C~100°C下震荡或搅拌0. 5 h ~120 h，转相之后油相的上转 换纳米颗粒转移到水相，相转移效率在70%~100%之间，其中，所述油相与水相的体积比为 1:0.01~100;所述上转换纳米颗粒在油相中的浓度为0. 05 ~500 mg/ml;向水相中投入的 所述多肽中含有的组氨酸的摩尔浓度在10° ~1〇12 nmol/L之间，所述多肽直接溶解在水中； 所述水相稳定是指在水溶液或者水的缓冲液中在4 ~ 60°C下静置4小时~15天，取上 层清液视为水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒，其中，所述组氨酸多肽修饰的 上转换纳米颗粒在水相中的沉降比例为〇 % ~ 40 %，在水相中紫外可见光吸收下降比例在 0 % ~ 40 % 〇
[0007] 上述技术方案中的有关内容解释： 1、上述方案中，HLB表示亲水疏水平衡值，数值越大亲水能力越好。
[0008] 2、上述方案中，四甲基罗丹明的英文名为TAMRA，菁染料琥珀酰亚胺酯3的英文名 为Cy 3,菁染料琥珀酰亚胺酯5. 5的英文名为Cy 5. 5、2, 5-二特丁基对苯二酚的英文名为 BHQ0
[0009] 3、上述方案中，油酸的英文名为Oleic acid，油胺的英文名为Oleylamine， 卜十八(碳）稀的英文名为lH3ctadecene。
[0010] 4、上述方案中，所述相转移