抗肝细胞衰老的pcl-pla组织工程复合支架的制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料技术领域。更具体地，涉及一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组 织工程复合支架的制备和应用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体内最大的实质性器官，也是机体最重要的生命器官之一。在体内发挥 着包括消化、解毒、合成、分泌等重要的生理功能，同时担负着凝血、免疫、新陈代谢、产热及 水电解质平衡等一系列复杂的生理功能。我国是慢性肝病的高发地区，其发病率和死亡率 均较高，急、慢性肝病，尤其是肝衰竭和肝癌，严重威胁人类生命健康。
[0003] 目前，肝移植仍然是多种肝脏疾病唯一可行的治愈方法，但是临床应用中往往存 在着器官短缺、肝脏供体紧缺、技术复杂、成本昂贵等种种难题。因此，用组织工程方法构建 出人工肝脏是临床医学和材料研宄者们的共同追求的目标。但是肝组织工程的发展依然需 要克服一系列技术挑战。组织工程三要素包括种子细胞、细胞外基质材料(支架材料）以及 组织与器官的构建与再生。肝组织工程以支架结构为评价重点，对肝组织工程支架进行仿 生设计或者修饰，结合现代科学技术制备多孔支架。搭建体外动态培养平台，将肝细胞种植 于支架上，进行体外动态培养，并通过形态学、功能学检测方法评价了新型三维支架对肝细 胞生长分化的促进作用，有望应用于组织工程肝的构建。对于肝组织工程，因其本身属于软 组织，所以对材料的力学性质并无太大要求，但肝脏系统是一个高度管道化的复杂性代谢 器官，制备适合的细胞外基质材料和如何将支架细胞复合体内的营养物质、代谢物进行转 运，是一个关键性问题。所以对材料的性能和结构有特殊的要求：（1)支架材料必须具有可 生物降解性和生物相容性，降解产物不应有毒和引起炎症；（2)材料具有可加工性以及孔 隙的大小和孔隙率可调控，以适应精细制造工艺，为预血管化和血管生成创造条件；（3)支 架材料应有足够的表面积用于细胞粘附，也应有足够的空间使细胞集落扩展，增殖。从肝组 织工程需要考虑，目前肝组织工程支架材料有两类，一类是天然基质材料如胶原，纤维连接 蛋白，层连蛋白，透明质酸，海藻酸钠，壳聚糖。它们均有较好的生物相容性，但其形成的支 架材料，难有好的稳定性和机械性能，缺乏可加工性；而肝细胞结构的复杂性要求材料需要 可加工性，这给天然基质的应用造成了障碍。另一类是合成高分子聚合物如PGA，PLA等其 生物降解性好，有良好的力学性能，降解速度可控等优点，但在生物相容性方面仍有一定的 缺陷。
[0004] 目前，肝组织工程支架材料仍然处于筛选阶段。因此，研宄者们为了解决以上材料 问题，采用了复合、修饰和改性的方法，扬长避短，借以获得一种良好的生物材料，这些修饰 可为种植于其上的细胞提供更合适的环境因素、生长因子以至于诱导新生血管形成的预血 管化位点和多孔结构，具体复合、修饰和改性方法主要有：材料复合、在生物材料表面固定 蛋白质进行表面修饰、在生物材料表面固定多肽进行修饰、在生物材料表面引进碳氢化合 物进行修饰、在生物材料表面进行尺寸和形状特征修饰等。运用材料复合的方法，是为了使 各种材料的优缺点互补，这类的复合国内外文献比较多，比如徐星等人制备的胶原/壳聚 糖/肝素复合物；Tack等人制备的海藻酸钠/半乳糖基化壳聚糖支架材料，相对于单纯的 支架材料，无论在各方面都取得不错的效果。通过在材料表面引进某些物质，通过肝细胞的 特异表面受体的认知，来增加细胞的黏附、扩展，蛋白如抗体、肽以及寡肽是通过和聚合物 一系列的相互作用来固定。但是由于这些物质的易变性，所以其溶剂和处理条件都比较苛 亥IJ。由王军等人制备的蛋白改性壳聚糖用于肝细胞培养，发现肝细胞粘附率提高，细胞存活 率增加，肝细胞功能的表达也达到了一定的水平。另外，细胞外基质蛋白包括纤维蛋白、层 粘连蛋白、胶原、弹性蛋白、层连蛋白以及用于聚合物包覆的细胞结合和黏附因子，而位于 这些蛋白上的受体包含有Arg-Gly-Asp (R⑶）三肽序列。而R⑶可以与整联蛋白受体相互 作用，因此聚合物通过表面的RGD与整联蛋白相互作用，可增强细胞的黏附，但是将多肽固 定在材料表面，由于空间阻碍而降低肽的活性，通过添加氨基酸的残基或其他基团，将肽固 定在材料，可以改变肽原来的功能，表现在肽活性的降低，所以在添加肽的时候应注意添加 基团的溶解度，复合物的二级结构，三级结构以及空间阻碍。通过在材料表面引进碳氢化合 物，增加细胞的黏附。如引进半乳糖，进行肝细胞特异受体来增加肝细胞的粘附率，如由JUN Yang制备出的半乳糖基化海藻酸盐支架材料，引进了碳氢化合物半乳糖基，用于肝细胞培 养，结果发现由于半乳糖的引进，有球形肝细胞体形成。最后一种表面修饰方法即在生物材 料表面进行尺寸和形状特征修饰，将底物表面制成具有一定尺寸和形状如腔、槽等的特征 性结构，模仿微环境。Junji等人用微制造和微打印技术，将胶原/聚乙二醇复合物支架材 料制成了具有微圆柱状槽的形态，直径大约300 μ m，密度大约有每平方厘米700个槽，槽 的底部分为两个不同的区域，支持细胞粘附的和不支持细胞粘附，在槽底部大约100 μm区 域内用胶原覆盖，形成细胞粘附区，其他则用聚乙二醇改性，种植肝细胞发现有球状肝细胞 体出现，细胞呈立方体形状和体内相同，其肝细胞功能也表达良好。
[0005] 生物材料科学是组织工程中的重要环节，材料组成、支架制备过程和支架结构三 个重要因素共同组成了支架材料的金三角，他们之间相互作用，共同决定支架性能，缺一不 可。组织工程材料是细胞粘附和增殖的载体，理想的支架材料应该满足以下条件：（1)支架 内部是连通的孔洞结构，能达到一定的孔隙率，为培养液的流动和细胞代谢物的排出提供 有利条件；（2)支架材料可吸收或可降解，并且与细胞或组织生长的速率相匹配；（3)材料 内部孔洞结构可为细胞的粘附和增殖提供足够的面积；（4)材料的机械性能与组织本身的 性能相一致；（5)材料易于加工成型，吸附率和存活率，功能表达也明显增加。因此，支架材 料的选择，以及其与活性因子的匹配或结合作用，是组织工程生物材料制备首要考虑的问 题。现今，肝组织工程研宄尚处于起步阶段，还存在许多问题，如选择异种肝细胞将面临免 疫排斥和异种病毒感染；生物反应器中细胞培养的血管化；组织、器官体外培养和构建等 方面等难题。人工肝的功能表达要求各种功能细胞共培养和各类生长因子协调作用等问题 亟待解决。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有肝组织工程生物材料的不足，提供一种新型 的、具有明显的抗肝细胞衰老作用的肝组织工程光接枝材料。
[0007] 本发明的目的是提供一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架。
[0008] 本发明另一目的是提供上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的制备 方法。
[0009] 本发明再一目的是提供上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的应用。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架，是以支架材料PCL-PLA为基础，光接 枝聚丙烯胺（PAAm)、IGF和TNF-a进行协同共修饰得到。
[0011] 具体地，上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架是由如下步骤制备得 到： 51. 利用PBS溶液分别溶解IGF和TNF-a，得到游离IGF溶液和游离TNF-a溶液； 52. 在游离IGF溶液和游离TNF-a溶液中分别加入DMF/PBS溶液进行反应，再分别加 入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液进行反应，得到光活性IGF溶液和光活性 TNF-a溶液； 53. 把DMF/PBS溶液溶解的聚丙烯胺（PAAm)与叠氮苯胺盐酸盐进行反应，得到光活性 PAAm ； 54. 剪裁支架材料PCL-PLA，用灭菌的PBS清洗后，加入光活性PAAm，冷冻干燥后，进 行光接枝，再加入光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液，冷冻干燥后，进行光接枝，得到 PCL-PLA 组织工程复合支架（PCL-PLA-PAAm- IGF/TNF-α )。
[0012] 更具体地，上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架是由如下步骤制备得 到： 51. 利用PBS溶液分别溶解IGF和TNF-a，得到游离IGF溶液和游离TNF-a溶液，分别 过滤灭菌； 52. 共固定IGF和TNF-a的制备 521. 步骤Sl所述游离IGF溶液和游离TNF-a溶液中分别加入体积比4:1的DMF :PBS， 磁力冰浴搅拌反应后，超滤； 522. 避光环境下将S21处理后的IGF与TNF- α分别加入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰 胺DMF/PBS溶液中，磁力冰浴搅拌反应后，分别超滤纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，得到 光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液； 53. 共固定聚丙烯胺（PAAm)的制备 531. 利用体积比4:1的DMF :PBS溶液溶解聚丙烯胺（PAAm)，磁力冰浴搅拌反应后超 滤； 532. 避光环境下，把S31处理后的聚丙烯胺（PAAm)与叠氮苯胺盐酸盐按物质的量 1:100加入棕色瓶进行反应，磁力冰浴搅拌反应后，超滤纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，得 到光活性PAAm ; 54. 支架材料的制备 541. 将支架材料PCL-PLA剪裁成1厘米见方大小，用灭菌的PBS清洗后，加入光活性 PAAm，冷冻干燥后，进行光接枝； 542. 接枝好的材料再加入光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液，冷冻干燥后，进行光接 枝，得到PCL-PLA组织工程复合支架。
[0013] 其中，优选地，步骤Sl所述游离