异甘草素及衍生物的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及异甘草素及其衍生物的新用途，具体涉及异甘草素及衍生物抗肿瘤以 及与抗肿瘤药物合用增敏、减少耐药性方面的应用。
【背景技术】
[0002] 异甘草素为一种黄酮类化合物，广泛存在于豆科植物中。现代药理研究表明，异甘 草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、治疗心血管病等用途。
[0003] 近年有抗肿瘤的治疗研究发现异甘草素具有抗肿瘤的活性，但对其与化疗药物共 用的增敏、减少耐药等效果未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用；
[0005] 本发明的第二个目的在于提供异甘草素及其衍生物在制备作为化疗药的增效剂 或减少化疗药耐药性药物中的应用。
[0006] 本发明的第三个目的在于提供一种抗肿瘤的药物组合物。
[0007] 本发明的第四个目的在于提供一种抗肿瘤的药剂盒。
[0008] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] 异甘草素及其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用；
[0010] 进一步，其特征在于在抑制肿瘤细胞增殖；
[0011] 进一步，其特征在于在诱导肿瘤细胞凋亡；
[0012] 进一步，所述肿瘤为乳腺肿瘤/肝脏肿瘤等肿瘤。
[0013] 异甘草素及其衍生物在制备作为化疗药的增效剂或减少化疗药耐药性药物中的 应用。
[0014] 从理论上讲，包含异甘草素的天然植物均具有抗肿瘤和与化疗药物协同增效、减 低抗药性的作用；此外由天然植物经常规提取得到的提取物同样具有上述作用。其中，所述 包含异甘草素的天然植物如豆科植物鸡血藤、甘草、黄芪、红芪等；所述提取物为水/乙醇 提取物，或水/乙醇提取物经进一步分离纯化得到的提取物。
[0015] 本发明还进一步提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该组合物由作为活性成分的异 甘草素或其衍生物及化疗药物组成，其剂量为临床所接受的常规剂量。
[0016] 进一步，所述异甘草素的日用剂量为2mg/kg- 100mg/kg。
[0017] 本发明组合物可按照常规工艺加入常规辅料制成药剂学可接受的任何制剂，如茶 齐IJ、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂或纳米制剂；也可与其他相关药 物配伍使用，制成相应的制剂。所述药学可接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬 齐IJ、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露 醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉 钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂 酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、 蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维 素等。
[0018] 本发明还提供了一种抗肿瘤的药剂盒，该药剂盒由异甘草素或其衍生物和化疗药 物组成，其中活性成分的重量比例为（5~150) :(0. 5~3)。
[0019] 进一步，活性成分的重量比为5:1. 5 - 50:1. 5。
[0020] 进一步，所述异甘草素的日用剂量为2mg/kg- 100mg/kg。
[0021] 本发明所述化疗药为临床常用的化疗药物，包括紫杉醇，多西他赛，长春新碱，门 冬酰胺，阿糖胞苷，环磷酰胺，比柔比星，氟尿嘧啶，硫嘌呤，阿霉素等。
[0022] 本发明所述异甘草素可以从市场购买，也可以从豆科植物鸡血藤、甘草中提取或 其它植物中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以通过化学合成或生物合 成方法得到，其结构式如下：
[0023]
[0024] 异甘草素
[0025] 本发明所述异甘草素衍生物为与异甘草素具有相同黄酮母核的化合物，本发明研 究发现异甘草素衍生物同样具有抗肿瘤、及与化疗药物协同增效、减低抗药性的用途。
[0026] 进一步，本发明所述异甘草素衍生物为新异甘草素，结构如下：
[0027]
[0028] 新异甘草素
[0029] 本发明研究表明，异甘草素及其衍生物以及包含异甘草素及其衍生物的均能够显 著抑制肿瘤细胞增殖及克隆，诱导肿瘤细胞凋亡；其与化疗药物联用能够实现增敏、减少耐 药性的目的。
【附图说明】
[0030] 图1异甘草素对癌细胞的长期增殖抑制作用
[0031] 图2异甘草素肿瘤细胞珠蛋白质表达的影响
[0032] 图3异甘草素对肿瘤组织LDH-A，HIF-Ia和Ki67的影响
[0033] 图4A异甘草素对正常组织(心肝脾肺肾）的影响
[0034] 图4B异甘草素对心脏和肌肉形态及其中LDH的表达
[0035] 实验例1异甘草素（ISL)对肿瘤细胞增殖及克隆形成的抑制作用
[0036] I.MTT法检测异甘草素对肿瘤细胞增殖的影响
[0037] I. 1实验方法
[0038] 分别取乳腺肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7,乳腺正常细胞株MCF-10A，肝肿瘤细 胞株7703、H印G2,肝正常细胞株L02,以3XIOVml的细胞浓度加至96孔板，180iil/孔。配 制各浓度异甘草素，使其终质量浓度分别为〇, 10, 20, 30,40, 50uM，每一浓度设5个平行孔。 同时设立对照孔（只含等体积细胞悬液，不加药物），空白调零孔（只含等体积完全培养基， 不加药物）分别培养24、48和72h以观时效。于每孔加10ill新配制的MTT溶液（IOmg/ ml)，培养箱中孵育4h;弃培养基，每孔加150iiLDMSO振荡5min，使结晶物充分溶解，用酶 标仪在490nm处测定吸光值（0Dvalue)。实验重复3遍，取平均值。
[0039] 1. 2实验结果
[0040] 实验结果见表1-2。
[0041] 表1异甘草素对肿瘤细胞增殖作用的影响
[0042]
[0043]
[0044] 表2异甘草素对正常细胞增殖作用的影响
[0045]
[0046] 结果显示异甘草素（ISL)能明显抑制乳腺肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖， 且具有明显量效与时效的关系。但对乳腺正常细胞MCF-10A则不具有上述特点。同时，异 甘草素（ISL)同样具有抗肝肿瘤细胞H印G2和7703的作用，但对肝的正常组织细胞L02抑 制作用很小，类似于对MCF-10A增殖作用。
[0047] 2.细胞克隆形成实验检测异甘草素对癌细胞生存、克隆形成的影响
[0048] 2. 1实验方法
[0049] 取对数生长期的MDA-MB-231、MCF-7、7703、IfepG2单层培养细胞，用0? 25%胰蛋白 酶消化并吹打成单个细胞，以每孔200个细胞的细胞浓度接种于六孔板中，两周后计数克 隆数目，细胞数大于30为一个克隆。终止培养，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1:3 醋酸/甲醇固定15分钟。加适量Giemsa染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染 色液，空气干燥。
[0050] 2. 2实验结果
[0051] 实验结果见图1。
[0052] 结果表明异甘草素（ISL)处理后细胞与对照组比较积落数明显减少，说明异甘草 素（ISL)有显着的影响乳癌及肝癌的细胞集落形成能力，即异甘草素（ISL)能抑制乳癌及 肝癌的生存能力，并具有量效依赖的关系，而对正常的细胞则不具有明显的抑制作用。
[0053] 实验例2异甘草素（ISL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用
[0054] 1异甘草素对肿瘤细胞周期的影响
[0055] I. 1实验方法
[0056] 将处于对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7,IfepG2和7703细胞，按每孔2X105个细 胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁过夜后加入异甘草素使终浓度为25uM和50uM，于37°C 作用24h。胰酶消化收集细胞，4°ClOOOr/min离心5min，弃上清液；用预冷的PBS重悬细 胞，4°C1000r/min离心5min，弃上清液；加入预冷的PBS300ul和预冷的无水乙醇700ul，迅 速润旋混匀；将该细胞悬液置于4°C固定过夜；第2天,4°C1000r/min离心5min,弃上清液； 加入预冷的PBS重悬细胞lml, 3000r/min离心5min,弃上清液；向细胞沉淀中加入预冷的 PBSO. 5ml和Rnase(终浓度10ug/ml)lul，涡旋混匀后，于37°C水浴15min;最后，加入碘化 丙啶(终浓度20ug/ml)2. 5ml，室温避光染色30min。用流式细胞仪检测细胞DNA含量，每 组样品分析IX104个细胞，实验结果采用CellQuest软件分析。
[0057] 1. 2实验结果
[0058] 通过细胞周期检测发现，加入异甘草素可显着抑制乳腺癌及肝癌细胞的细胞周期 进程，使G2/M期阻滞。
[0059] 2异甘草素对肿瘤细胞凋亡的影响
[0060] 2. 1实验方法
[0061] 将处于对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7,IfepG2和7703细胞，按每孔2X105个细 胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁过夜后加入异甘草素使终浓度为25uM和50uM，于37°C 作用24h。胰酶消化收集细胞，4°C1000r/min离心5min，弃上清液；预冷的PBS洗2次，细 胞重悬于冷的结合缓冲液。然后每0. 5毫升结合缓冲液加入AnnexinFITC染色溶液和溴 化丙啶（PI)染色溶液各5ul，室温避光孵育lOmin。用流式细胞仪检测。
[0062] 2. 2实验结果
[0063] 结果显示异甘草素能显着提高乳腺癌及肝癌细胞的凋亡，结果也提示了诱导癌细 胞凋亡可能是异甘草素抗肿瘤作用中的重要机制。
[0064] 实验例3异甘草素（ISL)对化疗增敏的体内外研究
[0065] 1异甘草素（ISL)对化疗增敏的体外研究 [0066]I. 1实验方法
[0067]MIT法检测：分别取MDA-MB-231、MDA-MB-231、MCF-7、MCF-7/ADR(乳癌阿霉素耐 药株)，以3X103/ml的细胞浓度加至96孔板，180iil/孔。配制各浓度异甘草素和化疗药 物，每一浓度设5个平行孔。同时设立对照孔（只含等体积细胞悬液，不加药物），空白调零 孔（只含等体积完全培养基，不加药物）分别培养24h。于每孔加10iU新配制的MTT溶 液（lOmg/ml)，培养箱中孵育4h;弃培养基，每孔加150iiLDMSO振荡5min，使结晶物充分 溶解，用酶标仪在490nm处测定吸光值（0D值）。实验重复3遍，取平均值。
[0068] 蛋白提取及免疫印迹检测：细胞分别经不同浓度的异甘草素处理，继续培养24h 后收集细胞，常规提取细胞蛋白。利用BCA法