山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术研发分析技术领域，特别是涉及到山羊角中寡肽成分治疗痛 经的分析方法。
【背景技术】
[0002] 山羊角为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角。气微腥，味淡，性寒。 据《中药大辞典》记载，山羊角的功用主治为"镇静，退热，明目，止血。治小儿惊痫，头痛，产 后腹痛，经痛"。山羊角化学成分多样，以角蛋白、肽类成分为主。其中，寡肽成分易吸收，活 性高等优点，已被广泛关注，但目前对山羊角寡肽治疗痛经的研宄尚未开展。
[0003] 肽键热振荡理论认为动物类药材中活性蛋白质在以热炮制过程中，经过肽键的热 振荡作用，导致其结构发生不同程度的改变，生理活性发生相应的变化。山羊角的加工炮制 具有历史考证，据《中药大辞典》记载："山羊角内服：磨粉或烧焦研末，1钱~2钱"，说明山 羊角经过热炮制化学成分及活性会有相应的变化，但现代研宄未见对山羊角炮制品的相关 报道，望此基础探索能给予山羊角炮制品的深入研宄及广泛应用提供少许提示。
[0004] 痛经是妇女常见病，发病率高且对妇女的健康和工作具有严重影响。痛经的发病 原因较复杂，中西医有着各自的观点。中医认为，痛经是因脉络受阻，气血运行不畅，不通 则痛，通则不痛。而西医认为痛经与子宫肌肉过度活动、张力增加或挛缩有关。当子宫肌 层收缩时，血流量减少，造成子宫缺血导致痛经的发生。但目前，普遍认为体内前列腺素 F2a(PGF2a)、缩宫素、血管加压素等过高可以引起子宫过度收缩，这可能是痛经的主要发病 机制。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方 法，通过制备离体大鼠子宫肌条，观察缩宫素、KCl溶液存在的条件下山羊角寡肽成分对子 宫平滑肌收缩的影响，进而验证不同山羊角寡肽成分治疗痛经的作用。
[0006] 山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法，其特征是：包括以下步骤，
[0007] 步骤一、取山羊角生品80g，进行粉碎至粒径为60目，取山羊角生品质量10倍量的 蒸馏水，添加至粉碎后山羊角生品中，在4°C的条件下，搅拌2次，每次持续10小时，转速为 3600r/min，离心10分钟后，取上清液；
[0008] 步骤二、将所述步骤一中获得的上清液经过双层滤油纸虑取后，经过0. 45ym滤 膜微滤、IKDaUOKDa超滤膜超滤，采用超滤分离纯化方法得到原子质量大于IOKDa的山羊 角蛋白、原子质量IKDa~IOKDa山羊角多肽、原子质量小于IKDa山羊角寡肽，取原子质量 小于IKDa山羊角生品寡肽成分，冻干备用；
[0009] 步骤三、取山羊角生品粉末置于150°C的马福炉中烘烤1小时后取出，呈微黄色， 经过降温和粉碎后，得到颗粒直径小于60目的粉末，获得150°C烘烤品；
[0010] 步骤四、取所述步骤三中获得的150°c烘烤品80g，重复所述步骤一和步骤二的操 作，得到山羊角150°C烘烤品寡肽成分，冻干备用；
[0011] 步骤五、取山羊角生品粉末置于200°c的马福炉中烘烤1小时后取出，呈黑棕色， 经过降温和粉碎后，得到颗粒直径小于60目的粉末，获得150°C烘烤品；
[0012] 步骤六、取所述步骤三中获得的200°C烘烤品80g，重复所述步骤一和步骤二的操 作，得到山羊角200°C烘烤品寡肽成分，冻干备用；
[0013] 步骤七、取所述步骤二中原子质量大于IOKDa的山羊角蛋白冻干粉80g，按照料液 质量比1:10加入蒸馏水搅拌至溶解，经过l〇〇°C水浴加热15min，待水温自动降至60°C，置 于恒温磁力搅拌器内，在保持60°C的条件下搅拌，添加0. 5mol/LNaOH溶液和HCl溶液，将 PH值调节至7. 5，加入3 %碱性蛋白酶进行水解，水解过程中以0. 5mo1/LNaOH溶液和HCl 溶液维持水解液pH值保持7. 5恒定，每隔30分钟调适一次pH值，水解过程为4h，水解结束 后，转入沸水浴中煮沸10分钟进行灭酶，冷却至室温，以3600r/min的转速离心20min，收集 上清液冷冻干燥，获得山羊角酶解寡肽冻干粉备用；
[0014] 步骤八、取24小时前皮下给药注射雌激素增敏的当即死亡野生褐生大鼠的变种 SD大鼠子宫，置于盛有洛氏液的培养皿中，剥离附着于子宫壁上的结缔组织和脂肪组织后， 将子宫壁悬挂于盛满洛氏液的麦氏浴槽中，子宫壁的一端固定在浴槽内T形钩上，另一端 与肌肉张力换能器连接，调节螺母加I.Og负荷，在保持温度恒定为37°C的条件下供氧，统 计时间段内子宫平滑肌条平均收缩张力、收缩频率以及收缩曲线下面积，计算出抑制率，选 取给药处理前IOmin内的子宫平滑肌条收缩力、收缩频率以及收缩曲线下面积；
[0015] 步骤九、将所述步骤八中获得的子宫平滑肌条在洛氏液中平衡lOmin，静止至子宫 收缩稳定，预先记录IOmin正常收缩曲线，加入缩宫素注射液0. 5mL，引起子宫平滑肌条剧 烈收缩，作用5min后，加入浓度为5. 5mg/mL的山羊角寡肽，观察并记录此后Omin~lOmin、 IOmin~20min、20min~30min内子宫平滑肌条收缩性的变化；分析山羊角寡肽对缩宫素 引起子宫收缩的抑制作用，采用t检验方法统计给药前及给药后子宫收缩力平均值；
[0016] 步骤十、将所述步骤八中获得的子宫平滑肌条在洛氏液中平衡lOmin，静止至待 子宫收缩稳定，预先记录IOmin正常收缩曲线，加入浓度为60mmol/L的KCl溶液引起子宫 平滑肌条剧烈收缩，作用5min后，加入浓度味5. 5mg/mL的山羊角寡肽，观察并记录此后 Omin~IOmirulOmin~20min、20min~30min内子宫平滑肌条收缩性的变化；分析山羊角 寡肽对KCl溶液引起子宫收缩的抑制作用，采用t检验方法统计给药前及给药后子宫收缩 力平均值；
[0017] 步骤十一、对比步骤九和步骤十获得的给药前及给药后子宫收缩力平均值，得到 山羊角中寡肽成分治疗痛经的活性分析结果。
[0018] 所述步骤八中的肌肉张力换能器通过计算机软件BL4207生物机能实验系统记录 肌条的收缩结果数据。
[0019] 所述步骤八中的抑制率通过给药前参数和给药后参数计算得出。
[0020] 通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：山羊角中寡肽成分治疗痛经 的活性分析方法，通过制备离体大鼠子宫肌条，观察缩宫素、KCl溶液存在的条件下山羊角 寡肽成分对子宫平滑肌收缩的影响，进而验证不同山羊角寡肽成分治疗痛经的作用。通过 此研宄可知，山羊角寡肽成分抑制缩宫素引起的子宫平滑肌收缩效果显著，有助于缓解痛 经，为山羊角寡肽成分治疗痛经提供佐证，并对山羊角寡肽成分的新产品的开发提供了理 论。
【附图说明】
[0021] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步的说明：
[0022] 图1为本发明山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法的流程示意框图。
[0023] 图2为本发明山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法中山羊角对缩宫素和KCl 引起子宫平滑肌收缩影响示意曲线图。
[0024] 图3为本发明山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法中山羊角炮制后对缩宫 素和KCl引起子宫平滑肌收缩影响示意柱形图。
[0025] 图中1-对缩宫素引起的收缩抑制率、2-对KCl引起的收缩抑制率、3-不同品质山 羊角对缩宫素引起的收缩抑制率、4-不同品质山羊角对KCl引起的收缩抑制率。
【具体实施方式】
[0026] 山羊角中寡肽成分治疗痛经活性分析方法，如图1所示，包括以下步骤，
[0027] 步骤一：取山羊角生品80g，经粉碎至粒径60目，加10倍量蒸馏水于4°C下搅拌2 次，每次10小时，3600r/min离心lOmin，取上清液。
[0028]步骤二：将步骤一得到的上清液用双层滤纸抽滤取上清液，再经0. 45ym滤膜微 滤，最后经IKDaUOKDa超滤膜，运用超滤技术分离纯化得到>IOKDa山羊角蛋白、IKDa~ IOKDa山羊角多肽、<IKDa山羊角寡肽，取<IKDa山羊角生品寡肽成分，冻干备用。
[0029] 步骤三：将山羊角生品粉末置于150°C马福炉中烘烤1小时后取出，呈微黄色。待 降温后粉碎后过60目筛，即得150°C烘烤品。
[0030] 步骤四：取150°c烘烤品80g，按步骤一、二操作，得到山羊角150°C烘烤品寡肽成 分。
[0031] 步骤五：将山羊角生品粉末置于200°C马福炉中烘烤1小时后取出，呈黑棕色。待 降温后粉碎后过60目筛，即得200°C烘烤品。
[0032] 步骤六：取200°C烘烤品80g，按步骤一、二操作，得到山羊角200°C烘烤品寡肽成 分。
[0033] 步骤七：精确称取步骤二中得到的山羊角>10KDa蛋白冻干粉80g，按1 :10料液比 加入蒸馏水搅拌溶解，于100°c水浴加热15min，待自然降至60°C时，置于恒温磁力搅拌器 中，保持60°C并低速搅拌，以0. 5mo1/LNaOH(HCl)调节pH值为7. 5，加入3 %碱性蛋白酶进 行水解，水解过程中以〇. 5mol/LNaOH溶液和HCl溶液维持水解液pH值保持7. 5恒定，每 隔30分钟调适一次pH值，酶解4h，水解结束后，迅速转入沸水浴中煮沸10分钟灭酶，迅速 冷却至室温，以3600r/min离心20min，收集上清液冷冻干燥，得山羊角酶解寡肽冻干粉，备 用。
[0034] 步骤八、取24小时前皮下给药注射雌激素增敏的当即死亡野生褐生大鼠的变种 SD大鼠子宫，置于盛有洛氏液的培养皿中，剥离附着于子宫壁上的结缔组织和脂肪组织后， 将子宫壁悬挂于盛满洛氏液的麦氏浴槽中，子宫壁的一端固定在浴槽内T形钩上，另一端 与肌肉张力换能器连接，调节螺母加I.Og负荷，在保持温度恒定为37°C的条件下供氧，统 计时间段内子宫平滑肌条平均收缩张