三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法。
【背景技术】
[0002]鼠尾草属(L.)是唇形科最大属，青臧尚原上主要分布二种鼠尾草种:粘毛鼠尾草roborowskii)、甘西鼠尾草(przewalskii Maxim.)及康定鼠尾草i Salvia prattii)。现代研宄表明鼠尾草属植物中的化学成分与丹参较为接近，其中具有较好的抗氧化活性成分。目前，从鼠尾草属植物中分离鉴定出的化学成分主要包括酚酸类及萜类，其中酚酸类化合物有望成为该原料的指标性化学成分之一，也是其主要抗氧化活性成分。
[0003]目前，已报道从甘西鼠尾草根中分离出酚酸类化合物甘肃丹参酸A、甘西鼠尾草酸 A、甘西鼠尾草酸 B 等(Lu XZ, Xu W H, Shen J X et al.Przewalskinic Acid A,a new phenolic acid from Salvia prewalskii Maxim.Chinese Chemical Letters,1991, 2(4): 301；ffang N, Niwa M, Luo H ff.Triterpenoids from Salvia przewalskii,Phytochemistry, 1988，27(1): 299~301 ;陈万生，贾鑫明，张卫东，等.甘西鼠尾草根化学成分研宄.药学学报，2003，38(5): 354~357)，从粘毛鼠尾草全草中分离得到迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、乙基迷迭香酸等酚酸类化合物(Wang S F，Li S，Li ZG et al.Triterpenoids and other compounds from Salvia roborowskii Maxim, Pharmazie,2001, 56(5): 420-422)o上述研宄报道主要集中于对甘西鼠尾草及粘毛鼠尾草通过柱色谱、结晶等复杂手段对其化学成分进行研宄，而有关三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分前处理方法的研宄未见文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化实施、重复性较好、质量稳定可控的三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法，包括以下步骤:
⑴提取:
将粘毛鼠尾草、甘西鼠尾草或康定鼠尾草中的一种全草阴干、粉碎，得到粉碎后的鼠尾草植物，该粉碎后的鼠尾草植物中按Ikg:4~8L的料液比加入体积分数为70%~95%的乙醇溶液或体积分数为80%~100%的甲醇溶液，在60°C ~95°C提取1~3 h后过滤，重复1~3次，合并得到滤液；所述滤液经减压干燥至膏状，即得深红色提取物；
⑵树脂柱色谱富集:
所述深红色提取物中加入其质量的5~10倍的体积分数为10~30%的甲醇溶液溶解，并经树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为40150%的甲醇溶液、体积分数为70°/『80%的甲醇溶液、体积分数为100%的甲醇按2~5倍的柱体积进行梯度洗脱，收集409^50%甲醇洗脱物；所述40。/『50%甲醇洗脱物经减压干燥即得酚酸类组分粗品；
⑶硅胶柱色谱除杂:
所述酚酸类组分粗品经硅胶柱色谱分离后，用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按2~5倍的柱体积进行洗脱，并500 mL每份收集馏分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0.15-0.25的馏分，该馏分经减压干燥后即得淡黄色粉末状的酚酸类组分。
[0006]所述步骤⑴、所述步骤⑵和所述步骤⑶中减压干燥的条件均是指真空度为0.04-0.09 MPa,温度为 40~65°C。
[0007]所述步骤⑵中树脂柱是指HP20SS型树脂柱或MCI型树脂柱。
[0008]所述步骤⑶中的娃胶柱的尺寸为30 mm~60 mmX60 mm -100 mm。
[0009]所述步骤⑶中的氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按8:2:0.2-7:3:0.5的体积比混合而成。
[0010]所述步骤⑶中的薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按8:2:0.2的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。
[0011]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用醇提，可直接将三种高山鼠尾草属植物中水溶性生物大分子成分保留在原料中；同时，溶剂可重复回收利用。
[0012]2、本发明采用树脂柱富集，可有效富集样品种酚类化合物，工艺简单，易于实施；同时，树脂柱可以再生循环使用且树脂价格低廉。
[0013]3、本发明采用硅胶柱除杂，可直接将三种高山鼠尾草属植物中脂溶性成分与酚酸类成分分开，同时除去部分强极性杂质。
[0014]4、本发明原料要求不高，一般市场上或野生原材料即可，易于批量备料。
[0015]5、本发明工艺简单、回收率高、重复性较好、质量稳定可控，所得到的三种高山鼠尾草属植物酚酸类组分经二维制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱、氢谱分析，依次判定主要含有迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、迷迭香酸乙酯及其他酚酸类化合物(参见图1)。同时，该酚酸类组分经抗氧化活性测试实验，发现均具有抗氧化活性，可作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
[0016]本实验利用已建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各酚酸类组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)作为对照，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下三种高山鼠尾草属植物酚酸类组分抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系，检测结果直观、易判断。体外细胞抗氧化药物筛选模型参照公开号为102899351A的中国发明专利“一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用”。
[0017]将经过筛选的对数生长期Hek293_ARE细胞经胰酶消化、计数后接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2 X 14个，在37°C，5%的CO2培养箱中培养24 h。为避免边缘效应，周围孔加入PBS ;每孔等量补充培养基。然后加入三种高山鼠尾草属植物前处理酚酸类组分，每孔加入相应浓度样品，使得各样品终浓度为20~50 mg/mL，每个浓度设3个重复；加阳性对照药物特丁基对苯二酚(TBHQ)，阳性对照终浓度同样为20~50 mg/mL,同时设空白对照，阳性对照与空白对照都设置5个重复。将加入了测试样品、对照品以及空白对照的细胞培养板放置在37°C，5% 0)2培养箱，继续培养24h，使用Steady-Glo?荧光素酶检测试剂盒检测各培养孔细胞中荧光素酶的活性。计算三种高山鼠尾草属植物各试验组分相对抗氧化活性(抗氧化活性是特丁基对苯二酚活性的倍数):相对抗氧化活性(%)=(测试组光强值-空白对照光强值)/ (阳性对照光强值-空白对照光强值)X 100%。各实施例得到的三种高山鼠尾草属植物酚酸类组分的相对抗氧化活性检测数据如图2所示。
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019]图1为本发明三种高山鼠尾草属植物前处理酚酸类组分的HPLC分析图谱(330nm)o
[0020]图2为本发明各实施例相对抗氧化活性检测图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1 三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法，包括以下步骤:
⑴提取:
将粘毛鼠尾草全草1.0 kg阴干、粉碎，得到粉碎后的鼠尾草植物，该粉碎后的鼠尾草植物中按Ikg:4L的料液比加入体积分数为75%的乙醇溶液，在60°C提取3 h后过滤，重复3次，合并得到滤液；滤液经减压干燥至膏状，即得深红色提取物。
[0022]其中:减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为40°C。
[0023]⑵树脂柱色谱富集:
深红色提取物中加入其质量的10倍的体积分数为10%的甲醇溶液溶解，并经树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为40%的甲醇溶液、体积分数为70%的甲醇溶液、体积分数为100%的甲醇按5倍的柱体积进行梯度洗脱，收集40%甲醇洗脱物；40%甲醇洗脱物经减压干燥即得酚酸类组分粗品180.4 go
[0024]其中:树脂柱是指MCI型树脂柱。
[0025]减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa,温度为40°C。
[0026]⑶硅胶柱色谱除杂:
酚酸类组分粗品经硅胶柱色谱分离后，用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按5倍的柱体积进行洗脱，并500 mL每份收集馏分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0.15-0.25的馏分，该馏分经减压干燥后即得淡黄色粉末状的酚酸类组分110.7 go
[0027]其中:减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为40°C。硅胶柱的尺寸为30mmX60 mm0
[0028]氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按8mL:2mL:0.2mL的体积比混合rfn 。
[0029]薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按8:2:0.2的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。
[0030]实施例2 三种高山鼠尾草属植物中酚酸类组分的前处理方法，包括以下步骤:
⑴提取:
将粘毛鼠尾草全草5.0 kg阴干、粉碎，得到粉碎后的鼠尾草植物，该粉碎后的鼠尾草植物中按Ikg:8L的料液比加入体积分数为95%的乙醇溶液，在95°C提取I h后过滤，重复I次，合并得到滤液；滤液经减压干燥至膏状，即得深红色提取物。
[0031]其中:减压干燥的条件是指真空度为0.04 MPa，温度为65°C。
[0032]⑵树脂柱色谱富集:
深红色提取物中加入其质量的5倍的体积分数为30%的甲醇溶液溶解，并经树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为50%的甲醇溶液、体积分数为80%的甲醇溶液、体积分数为100%的甲醇按2倍的柱体积进行梯度洗脱，收集50%甲醇洗脱物；50%甲醇洗脱物经减压干燥即得酚酸类组分粗品884.1 go
[0033]其中:树脂柱是指MCI型树脂柱。
[0034]减压干燥的条件是指真空度为0.04 MPa,温度为65°C。
[0035]⑶硅胶柱色谱除杂:
酚酸类组分粗品经硅胶柱色谱分离后，用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按3倍的柱体积进行洗脱，并500 mL每份收集馏分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0.15-0.25的馏分，该馏分经减压干燥后即得淡黄色粉末状的酚酸类组分496.2 go
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