用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物的制作方法

用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年11月13日、发明名称为"用于通过调整BMP-6来调节 铁稳态的方法和组合物"的中国专利申请号200980145449. 4的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求于2008年11月13日申请的美国临时专利申请61/114, 290以及于 2008年12月29日申请的61/141，155的优先权，这些申请的全部内容通过引用结合入本文 中。
技术领域
[0004] 本发明总体上涉及铁稳态失调的治疗、预防和改善。本发明更具体地涉及使用 BMP-6和BMP-6蛋白特异性试剂诸如抗体用于改变人的血清铁、血清血红蛋白和/或血细 胞比容水平的方法。此类抗体可用于预防和治疗血色素沉着病和炎症性贫血的药物组合物 中。
【背景技术】
[0005] 铁是几乎每一种生物体生长和生存所需要的必需元素。红细胞（RBC)含有血红蛋 白（Hb)，其是一种红色的富铁蛋白，将氧从肺携带至身体的所有肌肉和器官，在此其反应而 为身体提供其正常活动的能量需求。当红细胞的数目或它们含有的血红蛋白的量降低至正 常水平以下时，身体接收到的氧和产生的能量小于其正常发挥功能所需要的氧和能量。这 种状况通常称为贫血。在婴儿和儿童中贫血的常见病因是铁缺乏。在美国中多达20%的儿 童和发展中国家中多达80%的儿童在18岁前的某个时候将发生贫血。Martin，P. L.等，The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics(贫血，儿科学原理和实践），1657(第 二版，Lippincott 1994) 〇
[0006] 在哺乳动物中，铁平衡主要在十二指肠吸收膳食铁的水平上进行调节。在人类中， 遗传性血色素沉着病（HH)是由过多吸收膳食铁引起血浆和多个器官（包括特别地胰腺、肝 脏和皮肤）中的铁过载并且由于铁沉积引起这些器官和组织损害而导致的一种常见的常 染色体隐性遗传性疾病。
[0007] 青少年血色素沉着病是由编码主要的铁调节激素铁调素（h印cidin) (HAMP)和血 幼素（hemojuvelin) (HFE2)的基因中的突变导致的一种铁过载失调（Roetto，A.，等.2003. Nut. Genet. 33:21-22 ;Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36:77-82.)。已经显不血 幼素是一种骨形态发生蛋白（BMP)共同受体，且血幼素-介导的BMP信号调节铁调素表达 和铁代谢（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939.)。然而，铁调素的体内内源性BMP调节物还未知。
[0008] BMP是TGF-β超家族的成员，该超家族由超过40种配体组成（Shi，Y.和 Massague，J. 2003. Cell 113:685-700.)。这些生长因子介导多种多样的生物学过程，包括 细胞增殖、分化、凋亡和图形化（patterning)。BMP/TGF-β超家族配体通过与I型和II型 丝氨酸-苏氨酸激酶受体的复合物结合而启动细胞内信号级联放大。活化的受体复合物磷 酸化细胞内Smad蛋白，然后后者转位至核中以调整基因表达。
[0009] 近年来，已经发现了 BMP信号传导途径在主要的铁调节激素铁调素的调 节中的作用（Babitt，J.L·，等 2006.Nat.Genet.38:531_539;Babitt，J.L.，H 等 J Clin Invest. 117:1933-1939 ;Wang，R. H.，等 2005.Cell Metab. 2:399-409.)。 被 肝脏分泌后，铁调素通过减少铁运输因子（exporter)膜铁转运蛋白（ferroportin) 的细胞表面表达来抑制肠的铁吸收和巨噬细胞的铁释放（Nemeth，E.，等2004. Science. 306:2090-2093)。通过施用铁使铁调素上调（Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276:7811-7819, Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044 ;Nemeth，E., 等 2004. J. Clin. Invest. 113:1271-1276·)，而贫血抑制铁调素（Nicolas,G·，等 2002· J. Clin. Invest. 110:1037-1044)。铁调素缺乏和不受抑制的膜铁转运蛋白活性是遗传 性铁过载失调遗传性血色素沉着病的常见发病机制，其原因是HAMP本身、HFE2、HFE、 TFR2(编码2型转铁蛋白受体）的突变以及罕见的SCLA0A1 (编码膜铁转运蛋白）突变 (Pietrangelo，A. 2006. Biochim Biophys Actal763:700-710)。铁调素还被炎性细胞因 子诸如IL-6上调，并且铁调素过量与炎症性贫血的发病机制有关（Pigeon，C，等2001. J. Biol. Chem. 276:781卜7819, Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044 ; Nemeth，E·，等 2004. J.Clin. Invest. 113:1271-1276 ;Nemeth，E·，等 2003. Blood. 101:2461-2463 ;Weiss，G.和 Goodnough，L. Τ· 2005. N. Engl. J. Med. 352:1011-1023 ; Andrews NC. 2008. Blood. 112219-30.)〇
[0010] 通过肝脏特异性条件性敲除共用的BMP/TGF- β细胞内介质Smad4 (Wang，R. Η.，等2005. Cell Metab. 2:399-409.)，或通过HFE2(其编码BMP共同受体血幼素）的 突变（Papanikolaou，G·，等 2004. Nut. Genet. 36:77-82 ;Babitt，J.L·，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Huang，F.W.，等 J. Clin. Invest. 115:2187-2191 ;Niederkofler，V.，Sa lie, R.，Arber，S. 2005. J Clin Invest. 115:2180-6)，减少肝脏BMP信号传导与不适宜的低 铁调素表达和铁过载相关。BMP信号在体外转录水平上正向地增加铁调素表达（Babitt，J. L·，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt，J.L.，H 等 J Clin Invest. 117:1933-1939; Wang, R. Η·，等 2005. Cell Metab. 2:399-409 ;Truksa, J.，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10289-10293 ;Verga Falzacappa，M.V·，等 2008. J Mol Med. 86:531-40·)。在体 内施用铁增加肝脏BMP信号传导（Yu，P.B.，等2008. Nut Chem Biol. 4:33-41)。在体内施 用BMP增加铁调素表达并减少血清铁（Babitt，J.L.，H等J Clin Invest. 117:1933-1939)。 相反，在体内施用与人免疫球蛋白Fe的Fe部分融合的可溶性血幼素（HJV. Fe)(其选择性 地抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6,但不抑制BMP-7或BMP-9)，在体内抑制铁调素表达， 增加膜铁转运蛋白表达，动员网状内皮细胞铁储备，和增加血清铁（Babitt，J. L，等2007. J Clin Invest. 117:1933-1939.)。施用非选择性小分子BMP抑制剂Dorsomorphin也在体 内抑制铁调素表达和增加血清铁（Yu，P.B.，等2008. Nut Chem Biol. 4:33-41)。
[0011] 血幼素（也称为RGMc)是蛋白质的排斥导向分子（Repulsive Guidance Molecule)家族的成员，包括RGMa和DRAGON (RGMb)，它们共享50-60 %氨基酸同一性 (Samad, T. A.，等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036.)。象血幼素一样，RGMa (Babitt, J. L·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:29820-29827)和 DRAGON(Samad，T.A·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:14122-14129)也起BMP信号传导途径的共同受体的作用。
[0012] 存在着对用于调节铁调素表达和铁代谢的低成本的有效方法的需求。

【发明内容】

[0013] 本发明提供了调整BMP-6的新方法，所述方法用于治疗由于铁调素缺乏引起的铁 过载失调或由于铁调素过量引起的炎症性贫血。
[0014] 本发明涉及BMP信号传导途径的调节物，所述调节物在由于铁调素缺乏引起的铁 过载失调或由于铁调素过量引起的炎症性贫血的治疗中发挥作用。
[0015] 本发明涉及一种用于调节受试者中铁稳态的方法，所述方法包括向所述受试者施 用有效量的药物组合物，所述有效量以足以改变所述受试者中的铁稳态、血红蛋白水平和 /或血细胞比容水平的水平来调整BMP-6信号传导。在一些方面，所述组合物的施用减少 BMP-6信号传导。在一些方面，所述组合物包含能够结合BMP-6的试剂。在一些实施方案 中，所述试剂在残基TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO: 3)处结合BMP-6。在一些方面，所述试剂 是抗体。在一些方面，所述抗体竞争性地抑制BMP-6与可溶性人血幼素蛋白的结合。在某 些具体实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV. Fc或HJV. Hi s。在其他方面，所述抗体通过 在与可溶性人血幼素蛋白结合BMP-6的结构域无关的结构域处结合BMP-6来抑制BMP-6活 性。在某些具体的实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV. Fc或HJV. His。
[0016] 本发明涉及其中化合物的施用减少血幼素-介导的对铁调素表达的诱导的方法。 在一些方面，所述试剂以足以抑制血幼素和BMP-6之间的相互作用的量施用。在一些方 面，所述试剂优选地对人BMP-6的表达或活性的抑制超过对BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或 BMP-9的抑制。在一些方面，所述试剂结合BMP-6的亲和性比结合BMP-7的亲和性大至少5 倍。
[0017] 本发明提供了施用本发明的组合物的方法，其导致受试者中的血清铁水平增加或 血清转铁蛋白饱和度增加。本发明还提供了施用本发明的组合物的方法，其导致血红蛋白 或血细胞比容水平增加。
[0018] 本发明提供了施用本发明的组合物的方法，其导致BMP-6信号传导的增加。在 一些方面，所述组合物包含能够增加血清BMP-6水平的试剂。在一些方面，所述试剂增加 BMP-6表达水平。
[0019] 本发明提供了治疗受试者的方法，所述受试者具有遗传性血色素沉着病的一种或 多种症状，所述症状选自：增加的血清铁水平、增加的血清转铁蛋白饱和度、减少的铁调素 表达、减少的脾铁储备、增加的膜铁转运蛋白表达和组织铁过载。
[0020] 本发明提供了施用该组合物的方法，其减小BMP-6的表达水平。在一些方面，所述 组合物包含能够抑制BMP-6基因表达的试剂，其中所述试剂为反义DNA、siRNA、干扰RNA、微 小RNA(miRNA)或反义RNA，且其中BMP-6表达的减少足以增加所述受试者中的血清铁水平 或血清转铁蛋白饱和度。
[0021] 本发明提供了一种分离的单克隆抗体，其特异性地结合人BMP-6,其中所述人 BMP-6由SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列组成，并且所述结合抑制BMP-6的铁调节活性， 并且提供了包含所述分离的单克隆抗体的组合物，所述组合物包含足以增加受试者中的血 清铁水平或血清转铁蛋白饱和度的量的抗体。在一些实施方案中，分离的单克隆抗体竞争 性地抑制可溶性人血幼素蛋白与BMP-6的结合，从而将与BMP-6的结合减少25% -100%。 在某些具体实施方案中，可溶性人血幼素蛋白为HJV. Fe或HJV. His。在更具体的实施方 案中，分离的单克隆抗体竞争性地抑制BMP-6与抗BMP-6抗体的结合达25% -100%，所述 抗BMP-6抗体选自R&D Systems的针对人BMP-6的单克隆抗体，MAB507 (克隆74219) ;R&D systems的针对BMP-6的多克隆抗体，AF507 (lot CXL04A);和Santa Cruz多克隆抗体。在其 他实施方案中，分离的单克隆抗体在与结合HJV. Fc的结构域不同的结构域处结合BMP-6。
[0022] 本发明还提供了抗BMP-6抗体诸如人抗体，由嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、 单链Fv片段、F(ab'） 2片段、Fd、结构域抗体（dAb)、双抗体、maxibody和纳米抗体。在一些 方面，分离的单克隆抗体结合人BMP-6和鼠 BMP-6两者。
[0023] 本发明还提供了分离的核酸分子和表达载体，所述核酸分子包含编码抗BMP-6抗 体的核苷酸序列，所述表达载体包含与调控序列可操作地连接的所述核酸分子。
[0024] 本发明还提供了一种使用包含要求保护的载体或核酸分子的宿主细胞产生抗体 的方法，所述方法包括在合适的条件下培养要求保护的宿主细胞使得表达所述核酸以产生 所述抗体。
[0025] 本发明还提供了通过施用治疗有效量的（a)足够以足以改变铁稳态、血红蛋白 水平和/或血细胞比容水平的水平调整BMP-6信号传导的药物组合物和（b)红细胞生成 刺激物来治疗受试者的方法，所述受试者具有遗传性血色素沉着病的一种或多种症状。 示例性的红细胞生成刺激物包括促红细胞生成素、促红细胞生成素激动剂变体、以及结 合和活化促红细胞生成素受体的肽或抗体。红细胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯 汀（epoetin alfa)，β 依泊汀（epoetin beta)，δ 依泊汀（epoetin delta), ω 依泊汀 (epoetin omega), ι 依泊汀（epoetin iota), ζ 依泊汀（epoetin zeta)和它们的类似物， 模拟肽（mimetic peptide)、模拟抗体（mimetic antibody)和HIF抑制剂（参见美国专利 公布号2005/0020487,其全部公开内容通过引用合并）。具体地，促红细胞生成素包括，但 不限于，如下列专利或专利申请中公开的促红细胞生成素分子或其变体或类似物：美国专 利号 4, 703, 008 ;5, 441，868 ;5, 547, 933 ;5, 618, 698 ;5, 621，080 ;5, 756, 349 ;5, 955, 422 和 5, 856, 298;和 WO 91/05867 ;W0 95/05465 ;W0 00/24893 和 WO 01/81405,每一篇专利或专 利申请的全部内容通过引用合并入本文中。在某些示例性实施方案中，红细胞生成刺激物 选自由人促红细胞生成素和α达贝泊汀（darbepoetin)组成的组。
[0026] 本发明还提供了一种诊断与BMP-6相关的失调的方法，所述方法包括：(a)使来 自怀疑患有所述失调的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人 BMP-6结合的条件下接触；和（b)定量与所述抗体结合的BMP-6,其中如在（b)中所定量的 在所述样品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在与BMP-6相关的失调。
[0027] 本发明还提供了一种监测其中施用BMP-6拮抗剂的治疗的方法，所述方法包括： (a) 使来自已经施用了 BMP-6拮抗剂的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于 所述抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和（b)定量与所述抗体结合的BMP-6,其中如在 (b) 中所定量的血清BMP-6水平的量的变化指示BMP-6拮抗剂的功效。在一些方面，所述拮 抗剂是抗体或小分子。
[0028] 本发明还提供了一种治疗具有升高的铁水平或患有贫血的哺乳动物的方法，所述 方法通过施用调整BMP-6信号传导的药物组合物进行。
[0029] 本发明还提供了一种用于治疗与铁稳态相关的失调的试剂盒，所述试剂盒包含制 品，所述制品包括包含抗BMP-6抗体的小瓶或预充式注射器。
[0030] 本发明还提供了一种筛选与人BMP-6结合的化合物的方法，该方法包括使候选化 合物与包含生物活性BMP-6的组合物接触，和检测所述候选化合物和所述组合物中的人 BMP-6之间的复合物，其中检测到复合物指示所述候选化合物与人BMP-6的结合，并且进一 步其中所述候选化合物将BMP-6与HJV. Fc的结合抑制至少25%。
[0031] 本发明还提供了一种生成针对人BMP-6的抗体的方法，该方法包括将免疫球蛋白 生成细胞与包含SEQ ID NO: 1的BMP-6序列或其变体的多肽接触，并分离由所述细胞产生 的免疫球蛋白。
[0032] 本发明还提供了一种用于治疗缺铁性失调的组合物，其包含特异性结合BMP-6和 HJV. Fc的抗体。在一个实施方案中，抗体竞争性地抑制可溶性人血幼素缀合物（HJV. Fe)蛋 白与BMP-6的结合。在另一个实施方案中，抗体竞争性地抑制可溶性人血幼素缀合物（HJV. Fe)蛋白与BMP-6的结合。在另一个实施方案中，抗体结合BMP-6上的与结合HJV. Fe的结 构域不同的结构域。
[0033] 在另一个具体实施方案中，抗体的量足以将HJV.Fc与BMP-6的结合减小 25% -100%。优选地，抗体选自由RandD系统单克隆抗体、RandD系统多克隆抗体和Santa Cruz多克隆抗体组成的组。在另一个具体实施方案中，抗体是人抗体。在其他实施方案中， 所述抗体选自由嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、单链Fv片段、F (ab'）2片段、Fd、结构域 抗体（dAb)、双抗体（diabody)、maxibody和纳米抗体组成的组。
[0034] 本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码特异性结合BMP-6的抗体的核 苷酸序列。本发明还提供了一种包含与调控序列可操作地连接的此核酸分子的表达载体。 本发明还提供了包含权利要求31所述的载体或权利要求30所述的核酸分子的宿主细胞。
[0035] 本发明还提供了一种使用权利要求32所述的宿主细胞产生抗体的方法，其包括 在合适的条件下培养该权利要求所述的宿主细胞使得所述核酸表达以产生所述抗体。
[0036] 本发明还提供了一种诊断与BMP-6相关的失调的方法，所述方法包括：使来自怀 疑患有所述失调的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述抗体与人BMP-6 结合的条件下接触；和定量与所述抗体结合的BMP-6,其中如在（b)中所定量的所述样品中 BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在与BMP-6相关的失调。