糖原贮积病的基因疗法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年10月17日提交的美国临时申请第61/715, 187号的权益，其 内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生 物，其等位基因变体及其片段；包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生 物，其等位基因变体及其片段的嵌合分子；编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物 技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；经遗 传工程改造的表达所述多肽的宿主细胞或者用于治疗或/和预防糖原贮积病的药物组合 物。优选庞帕病或达农（Danon)病。 技术背景
[0004] 已经基于不同的策略和理论探索了用于治疗溶酶体贮积病（LSD)的多种治疗方 法。这些包括造血干细胞移植（HSCT)、酶替代疗法（ERT)、减少底物疗法（SRT)、药理学伴护 疗法（PCT)和基因疗法（GT)。
[0005] 一般而言，这些方法可分为两个大类：目标在于增加失去的酶的残留活性的那些 (如HSCT、ERT、PCT和GT)以及旨在减少积累底物的合成的那些（SRT)。通常，这些疗法的 目标是恢复所谓的"贮积方程"的平衡，其为底物合成和分解之间的平衡。
[0006] 然而，这些方法各自通常仅指示特定疾病，并且它们中的许多不能完全治愈多系 统疾病（如LSD)的各个方面。
[0007] 庞帕病是溶酶体贮积病，也属于糖原贮积病类，其由溶酶体水解酶酸α -葡糖苷 酶（GAA)，一种糖原降解性溶酶体酶的缺陷或功能障碍所致。GAA的缺陷导致在庞帕病患者 的许多组织中的溶酶体糖原的积累，其心脏和骨骼肌组织受到最严重的影响。所有形式的 庞帕病合计发生率估计为1 : 40, 000,并且该疾病影响所有的群体而没有种族倾向。估计 大约三分之一的庞帕病患者具有快速发展的、致命的婴儿发病型的病症，而大多数的患者 存在较缓慢发展的、青少年或晚发性的病症。
[0008] 现在，仅有的批准用于庞帕病的治疗，酶替代疗法，已经显示出严重局限（Schoser 等· （2008) "Therapeutic approaches in glycogen storage disease type II/Pompe Disease(在II型糖原积病/庞帕病中的治疗方法）'Weurotherapeutics 5 :569-7)。例 如，虽然经过治疗，但是一些患者只获得有限的临床益处，尤其是在骨骼肌中，或者显示出 疾病发展的迹象。
[0009] 达农病也是由溶酶体酶，尤其是LAMP2基因中的突变造成的糖原贮积病，该基因 编码溶酶体膜的基本组分并且似乎在自噬体-溶酶体融合中起到作用。达农病的特征在于 严重的心肌病和不同程度的肌无力，经常与智力缺陷相关联。还没有针对这种疾病的特定 治疗。
[0010] 庞帕病和达农病属于糖原贮积病（GSD，也称为糖原病和糖原贮积症）。GSD归因于 在糖原合成或在肌肉、肝脏和其他细胞类型中降解的过程中的缺陷。GSD有两类原因：遗传 性和获得性。遗传性GSD是由这些过程中涉及的代谢（遗传上有缺陷的酶）的任何先天性 障碍造成的。总之，根据在英属哥伦比亚中的一项研宄，每100000个新生儿中大约有2. 3位 儿童（四万三千分之一）患有某种形式的糖原贮积病。在美国，估计在每20000-25000个 新生儿中出现1例。荷兰研宄估计为四万分之一。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了糖原贮积病，尤其是庞帕病或达农病的改善疗法。本发明部分基于 如下发现：可使用基因疗法将转录因子EB (TEEB)(碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因 子MiTF/TFE家族成员）有效递送至骨骼肌以诱导溶酶体胞吐并将积累的贮积材料排到胞 外空间中，导致有效清除肌肉中的糖原贮积并缓解肌肉病变。因此，本发明首次证明通过清 除主要患病组织（如骨骼肌中）TFEB过表达诱导的积累底物，可治愈糖原贮积病，尤其是庞 帕病或达农病的临床表现。
[0012] 因此，本发明的目的是选自下组的化合物：
[0013] a)转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等 位基因变体及其片段；
[0014] b)包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变 体及其片段的嵌合分子；
[0015] c)编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因 变体及其片段的多核苷酸；
[0016] d)包含所述多核苷酸的载体；
[0017] e)经遗传工程改造的表达所述多肽的宿主细胞
[0018] 其用于治疗或/和预防糖原贮积病。
[0019] 优选地，糖原贮积病的特征在于糖原在肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统中的积 累。
[0020] 更优选的，糖原贮积病选自下组：Ia型GSD(肝糖原累积症）、I非a型GSD(各种 亚型）、II型GSD (庞帕病）、IIb型GSD (达农病）、III型GSD (科里病或福布斯病）、IV型 GSD (安德森病）、V型GSD (麦卡德尔综合征）、VI型GSD (赫斯病）、VII型GSD (他瑞（Tarui) 病）、IX型GSD、XI型GSD (范科尼-彼克（Fanconi-Bickel)综合征）、XII型GSD (红细胞 醛缩酶缺陷）、ΧΠΙ型GSD和0型GSD。
[0021] 而优选的糖原贮积病是庞帕病或达农病。
[0022] 优选地，将该化合物递送至含积累糖原的目标组织。优选地，目标组织选自肌肉、 肝脏、心脏和/或神经系统。优选地，目标组织是肌肉和/或肝脏。更优选地，该肌肉是骨 骼肌、心肌和/或隔膜。优选地，通过全身性给药递送该化合物。优选地，全身性给药是静 脉内给药。
[0023] 在一个优选的实施方式中，通过局部给药递送该化合物。优选地，局部给药是肌肉 内给药。在优选的实施方式中，TFEB蛋白包含与SEQ ID NO :2至少80%相同的氨基酸序 列。
[0024] 优选地，TFEB蛋白包含与SEQ ID NO :2至少90%相同的氨基酸序列。更优选地， TFEB蛋白包含由SEQ ID NO :2组成的氨基酸序列。
[0025] 在一个优选的实施方式中，多核苷酸包含控制TFEB蛋白表达的组织特异性启动 子序列。
[0026] 优选地，该组织特异性启动子序列是肌肉特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO :3组成的MCK启动子序列：
[0027] CTAGCAATTAGCTAGCTGGGAAAGGGCTGGGCCCCATGTAAATATTTCTAAAGCACCCCTCTCCCCTCC CCCCTCAGATCAGGAGTCTGAGGGAGAGGCACAGAGGCTCCCTTTCTCTAAGCCAGTCCTCACCTGCCTAAGAAGAT GTGAAGGAGACCCAGGAGACCCTGGGATAGGGAGGAACTCAGAGGGAAGGGACATTCTTTTCTTCGTCGCAATCCTG GGAGCTCCCTGGAGGAGGAGACCCGATCAGCCTGCAATCCTGGCGCGTCCCAGGAGGAGAAAGCGGCTTCCTCTATA CTGTACTCTCCTCCACAGAACCCCCCTCTCAGCCCTGGAAGTCCTTGCTCACAGCCGAGGCGCCGAGAGCGCTTGCT CTGCCCAGATCTGCGCGAGTCTGGCGCCCGCGCTCTGAACGGCGTCGCTGCCCAGCCCCCTTCCCCGGGAGGTGGGA GCGGCCACCCAGGGCCCCGTGGCTGCCCTTGTAAGGAGGCGAGGCCCGAGGACACCCGAGACGCCCGGTTATAATTA ACCAGGACACGTGGCGAACCCCCCTCCAACACCTGCCCCCGAACCCCCCCATACCCAGCGCCTCGGGTCTCGGCCTT TGCGGCAGAGGAGACAGCAAAGCGCCCTCTAAAAATAACTCCTTTCCCGGCGACCGAGACCCTCCCTGTCCCCCGCA CAGCGGAAATCTCCCAGTGGCACCGAGGGGGCGAGGGTTAAGTGGGGGGGAGGGTGACCACCGCCTCCCACCCTTGC CCTGAGTTTGAATCTCTCCAACTCAGCCAGCCTCAGTTTCCCCTCCACTCAGTCCCTAGGAGGAAGGGGCGCCCAAG CGCGGGTTTCTGGGGTTAGACTGCCCTCCATTGCAATTGGTCCTTCTCCCGGCCTCTGCTTCCTCCAGCTCACAGGG TATCTGCTCCTCCTGGAGCCACACCTTGGTTCCCCGAGGTGCCGCTGGGACTCGGGTAGGGGTGAGGGCCCAGGGGG CACAGGGGGAGCCGAGGGCCACAGGAAGGGCTGGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACG TGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCA CTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGG CTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAG AACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCC CTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCGGCCGCC(来自 Tessitore A.等，Mol Ther，2007)
[0028] 优选地，该组织特异性启动子序列是肝脏特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO :4组成的PEPCK启动子序列：
[0029] CTTTGGGGAGTCCTAAGAGGGCAGCTGGCAATGGACACCTAGCAGTCCCTTTGAGACTTATTTCAGATG GAGCTGTAGAAAGATGCCATGGCTCACAGTGCCTCCCTGGGAAGGGGGCAGAGGGCTGCCCAGTGAGGCCTCTTGCG AGCAGGAAATCACCAGAGACAAGGAAAGACCAGACCCCAGGATGACCTCAGTTAGGCCTTGCCCGACTGTCCTCAGA GTCCCATTCTCTGTGTCCTGGTTCTTTTAGAAGATCATGGACCTCCAGGTCATTTCGTAACCGGAATCTGCCTGCGG GGGGTTTTGACAAGCTATGGTATAGTGTATGTGGGGGTACTGACGAATTGGAAGATCATGGAGACCCCTTCTCCTCC TCCATCATTGGTCTGCCACATCCCTCCCAGGCGACTCACAGCAGAGAGACCTTGGATGTATGTAGGGTGCTTTAAAA CTCCAGCTGAGTTACAGTCTCTCCTTTCTGTTTTCACCTTAACCTTCCAGGGATGCAAACCCACGACAGGTTTAGCA GCAGAGTGGAGGCTGGCCATGAATCTCAGAGAAAGTGCTCACTGGAAAGGCTGGTTTAGCCCAGGCCTGATGTGGAG GCACTGAGCTGGACGTTCTAGCGGGGTTGACACCCAACAGTTTACATAGGGGGAGGCCACCCCTCCTGAGCAGTCTC GGTGACTTGAAGAGGAAGCCGCTTCTTCTGTACCAACACAGAAGCTCCAGCGAACCCCCAGAATGCTGGCAGTGTGG GTGCTATGTAAAAGTATTTACATAGCTTTGTAGAGTGAGCCAAGCCCAGTCTGTTTGGGATGACTCTTCACAGTGCC TCGAATCTGTCACACGTCTTAGTAAGCAGAGTCACAGAGTTTCTGTCACATCATCCTCCTGCCTACAGGGAAGTAGG CCATGTCCCTGCCCCCTACTCTGAGCCCAGCTGTGGGAGCCAGCCCTGCCCAATGGGCTCTCTCTGATTGGCTTCTC ACTCACTTCTAAACTCCAGTGAGCAACTTCTCTCGGCTCGTTCAATTGGCGTGAAGGTCTGTGTCTTGCAGAGAAGG TTCTTCACAACTGGGATAAAGGTCTCGCTGCTCAAGTGTAGCCCAGTAGAACTGCCAAGCCCCTTCCCCTCCTCTCC CTAGACTCTTGGATGCAAGAAGAATCCAGGCAGCTCCAAGGGTGATTGTGTCCAACCTAGAATGTCTTGAAAAAGAC ATTAAGGGGACTAGAGAAGACAGGGGATCCAACGGTTCTCTGCAGCCCAGCCTGACTGACATGTAACTCTTCTGGTT CTCACCAGCCAGCTGGACCTGCTTAGTATTCTTTCTGCCTCAGTTTCCCAGCCTGTACCCAGGGCTGTCATAGTTCC ATTTCAGGCAGTAGTAATGAATGAGCTGACATAAAACATTTAGAGCAGGGGTCAGTATGTATATAGAGTGATTATTC TATATCAGGCATTGCCTCCTCGGAATGAAGCTTACAATCACCCCTCCCTCTGCAGTTCATCTTGGGGTGGCCAGAGG ATCCAGCAGACACCTAGTGGGGTAACACACCCCAGCCAACTCGGCTGTTGCAGACTTTGTCTAGAAGTTTCACGTCT CAGAGCTGAATTCCCTTCTCATGACCTTTGGCCGTGGGAGTGACACCTCACAGCTGTGGTGTTTTGACAACCAGCAG CCACTGGCACACAAAATGTGCAGCCAGCAGCATATGAAGTCCAAGAGGCGTCCCGGCCAGCCCTGTCCTTGACCCCC ACCTGACAATTAAGGCAAGAGCCTATAGTTTGCATCAGCAACAGTCACGGTCAAAGTTTAGTCAATCAAACGTTGTG TAAGGACTCAACTATGGCTGACACGGGGGCCTGAGGCCTCCCAACATTCATTAACAACAGCAAGTTCAATCATTATC TCCCCAAAGTTTATTGTGTTAGGTCAGTTCCAAACCGTGCTGACCATGGCTATGATCCAAAGGCCGGCCCCTTACGT CAGAGGCGAGCCTCCAGGTCCAGCTGAGGGGCAGGGCTGTCCTCCCTTCTGTATACTATTTAAAGCGAGGAGGGCTA GCTACCAAGCACGGTTGGCCTTCCCTCTGGGAACACACCCTTGGCCAACAGGGGAAATCCGGCGAGACGCTCTGAG
[0030] 在优选的实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO :1至少60%相同的核苷酸序 列。优选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO :1至少80%相同的核苷酸序列。更优选地，多核 苷酸包含由SEQ ID NO :1组成的核苷酸序列。
[0031] 在优选的实施方式中，载体是选自下组的表达载体：病毒载体、质粒、病毒颗粒和 噬菌体。
[0032] 优选地，该病毒载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关 载体（AAV)和裸质粒DNA载体。
[0033] 优选地，该 AAV 载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 及其组 合。
[0034] 更优选地，该AAV载体是AAVl、AAV2或AAV9载体。
[0035] 更优选地，AAV载体是嵌合和/或假型载体。
[0036] 优选地，所述分子的递送导致在肌肉和/或肝脏中糖原贮积的减少。优选地，该肌 肉是骨骼肌。
[0037] 更优选地，所述分子的递送导致在肌肉和/或肝脏中糖原贮积的强度、严重程度 或频率降低或延迟发生。
[0038] 本发明的另一个目的是用于治疗和/或预防糖原贮积病的药物组合物，该组合物 包含药学上可接受的赋形剂和前述权利要求中任一项所定义的化合物。
[0039] 本发明的另一个目的是治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要治疗的对象 递送编码转录因子EB (TFEB)基因的核酸的步骤。
[0040] 在该方法中，优选地，将编码TFEB基因的核酸递送至含积累糖原的目标组织。更 优选地，目标组织选自肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统。更优选地，目标组织是肌肉和/或 肝脏。更优选地，该肌肉是骨骼肌、心肌和/或隔膜。在该方法中，优选地，通过全身性给药 递送核酸。优选地，全身性给药是静脉内给药。优选地，通过局部给药递送核酸。更优选 地，局部给药是肌肉内给药。更优选地，核酸是病毒载体。优选地，病毒载体是腺相关病毒 (AAV)载体。
[0041] 更优选地，该 AAV 载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 及其组 合。优选地，该AAV载体是AAVl、AAV2或AAV9载体。更优选地，AAV载体是嵌合和/或假 型载体。
[0042] 在一个优选的实施方式中，该核酸